高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定功能性飲料中13種食品添加劑

史立學(xué) 毛煥軍 李全合 趙麗 胡瑩瑩 馬斌

摘要 [目的]建立HPLC法同時(shí)測(cè)定功能性飲料中13種食品添加劑含量的分析方法。[方法]樣品經(jīng)稀釋過(guò)濾后直接進(jìn)樣;流動(dòng)相為甲醇-0.02 mol/L乙酸銨梯度洗脫。[結(jié)果]13種食品添加劑在30 min內(nèi)能夠很好地分離，濃度在1～100 μg/mL具有良好的線性關(guān)系（ R 2>0.999）;檢出限在0.03～0.78 mg/kg，樣品加標(biāo)回收率在85.2%～103.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.68%～4.27%。[結(jié)論]該方法前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、回收率和精密度等滿足檢驗(yàn)要求，適用于功能性飲料中添加劑的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 功能性飲料;食品添加劑;高效液相色譜

中圖分類號(hào) TS 272.7 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2021）15-0185-03

Abstract [Objective]To establish an analytical method for the simultaneous determination of 13 food additives in functional beverages by HPLC.[Method]The sample was directly injected after dilution and filtration.The mobile phase was gradient elution of methanol -20 mmol/L ammonium acetate， and quantitative analysis by external standard method. [Result]13 kinds of food additives could be separated well within 30 minutes， and the concentration was 1-100 μg/mL with a good linear relationship （ R 2>0.999）.The detection limit was 0.03-0.78 mg/kg， the sample recovery rate was 85.2%-103.4%， and the relative standard deviation （RSD） was 0.68%-4.27%.[Conclusion]The method has the advantages of simple pretreatment， good repeatability， recovery precision and so on， and is suitable for the determination of additives in functional drinks.

Key words Functional drinks;Food additives;High performance liquid chromatography

作者簡(jiǎn)介 史立學(xué)（1987—），男，甘肅天水人，工程師，碩士，從事食品安全分析與檢驗(yàn)檢測(cè)研究。

收稿日期 2021-03-17

功能性飲料一般是指通過(guò)調(diào)整飲料中營(yíng)養(yǎng)素的成分和含量比例，在一定程度上能夠調(diào)節(jié)人體功能的飲料。功能性飲料大多含有維生素、葡萄糖、礦物質(zhì)以及鉀、鈉、鈣、鎂等，成分與人體體液相似，飲用后能迅速被人體吸收，深受人們的青睞。但因某些不法商販為達(dá)到降低成本、保證產(chǎn)品色澤、延長(zhǎng)保質(zhì)期等目的，而致使過(guò)量添加相關(guān)食品添加劑（主要包括防腐劑、甜味劑、合成色素等）[1-2]。在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[3]以及《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則（2021年版）》中對(duì)飲料中的各類添加劑的檢測(cè)和限量有明確要求。

經(jīng)文獻(xiàn)查閱，食品中各類添加劑以及人工合成色素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、超高效液相色譜法等[4-11]。其中高效液相色譜法因其靈敏度高、重復(fù)性好、檢測(cè)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已成為食品、醫(yī)藥和環(huán)境領(lǐng)域廣泛使用的分析方法。該試驗(yàn)建立了采用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)功能性飲料中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、咖啡因、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅B共13種化合物的分析方法，并對(duì)功能性飲料中可能添加的甜蜜素、脫氫乙酸進(jìn)行了干擾試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津液相色譜儀（日本島津），配有PDA檢測(cè)器;旋渦混勻器（Thermo Scientific）;超聲波清洗機(jī)（寧波新芝）;分析天平（賽多利斯）;冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific）;移液槍（Eppendorf）。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)置于壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司且濃度均為1 000 μg/mL，包括山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素、脫氫乙酸、水中8種合成色素混標(biāo)（檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅B）;咖啡因（純度≥99.8%）購(gòu)置于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;無(wú)水乙醇（色譜純）;超純水（屈臣氏）;乙酸銨（優(yōu)級(jí)純）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）。準(zhǔn)確稱取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

依次吸取1 000 μg/mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，混勻后用水定容至10 mL容量瓶中，制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后吸取混合后標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，用水定容至10 mL，各自制成100、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，上述操作避光進(jìn)行。

1.4 色譜條件

色譜柱為InertSustain C18（5 μm×4.6 mm×250 mm）;柱溫35 ℃;流動(dòng)相為甲醇-0.02 mol/L乙酸銨;流速1.0 mL/min;流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確稱取約5 g（精確至0.001 g）試樣于50 mL容量瓶中，加水25 mL，渦旋、超聲后，用水定容至刻度。混勻后取適量溶液，過(guò)0.22 μm濾膜，直接上機(jī)分析。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的梯度優(yōu)化

由于目標(biāo)化合物種類較多，等度洗脫很難將其分離，所以采用梯度洗脫以提高分析效率和分離效果，不同比例的流動(dòng)相對(duì)化合物的分離影響顯著，尤其是甲醇在流動(dòng)相中所占比例對(duì)化合物保留時(shí)間有較大影響[12]。通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定以0.02 mol/mL乙酸銨∶甲醇（95∶5）為初始流動(dòng)相，按照梯度洗脫條件進(jìn)樣，該梯度洗脫程序在30 min內(nèi)能夠較好地對(duì)樣品進(jìn)行分離檢測(cè)。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～800 nm對(duì)所有目標(biāo)化合物進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，參考國(guó)標(biāo)GB 5009.28—2016和GB 5009.35—2016等標(biāo)準(zhǔn)方法，山梨酸、苯甲酸、糖精鈉吸收波長(zhǎng)為230 nm，8種合成著色劑吸收波長(zhǎng)為254 nm，而咖啡因、安賽蜜、脫氫乙酸、甜蜜素在254 nm波長(zhǎng)下均有吸收，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，13種目標(biāo)化合物在254 nm均有吸收，所以最終選擇254 nm為吸收波長(zhǎng)。

2.3 甜蜜素、脫氫乙酸干擾試驗(yàn)

對(duì)于功能性飲料中有可能加入的甜蜜素和脫氫乙酸進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，二者均能在該方法下與其他添加劑有效分離，不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.4 線性范圍和檢出限

按“1.4”色譜條件對(duì)13種食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣濃度從低到高，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比（ S/N ）作為方法的檢出限，其線性關(guān)系、決定系數(shù)和檢出限見(jiàn)表2。

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

按“1.5”方法制備18份陰性加標(biāo)樣品，分別加入10、50、100 μg/mL 3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算13種化合物的回收率和精密度，結(jié)果表明（表3），13種化合物的平均回收率在85.2%～103.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不大于4.27%，所建方法的回收率和精密度均滿足檢測(cè)要求。

2.6 樣品測(cè)定

隨機(jī)抽取市場(chǎng)銷售功能性飲料，按照“1.5”方法進(jìn)行樣品處理后上機(jī)分析，結(jié)果均符合 GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[3]規(guī)定的最大允許值，樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)建立了一種高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)功能性飲料中13種添加劑的分析方法，方法簡(jiǎn)化了前處理操作，對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)排除了甜蜜素和脫氫乙酸的干擾，并隨機(jī)抽取市售飲料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法具有前處理簡(jiǎn)單、分離度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于功能性飲料中添加劑的測(cè)定。

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