一株具有滑行能力的革蘭氏陰性細(xì)菌的遺傳操作體系構(gòu)建

謝云軒

摘 要：開發(fā)全新來源的抗生素菌種資源在當(dāng)前臨床可用抗生素資源緊缺的情況下具有十分重要的意義。具有滑行能力的捕食細(xì)菌擁有豐富的次生代謝資源，是開發(fā)新型抗生素的理想菌株。在本研究中，一株從渤海沿岸石油烴污染土壤中分離得到的嗜麥芽窄食單胞菌展示出具有合成豐富代謝物的能力。對該菌株的基因組成分析顯示基因組中存在新穎聚酮合成酶-非核糖體多肽合成酶（PKS-NRPS）基因簇。本研究探討了利用接合轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行聚酮合成酶基因簇的原位敲除的可行性，發(fā)現(xiàn)利用該方法進(jìn)行基因敲除有約2.5%的概率獲得正確重組子。

關(guān)鍵詞：嗜麥芽窄食單胞菌;聚酮合成酶-非核糖體多肽合成酶;生物信息學(xué)分析;接合轉(zhuǎn)移

微生物來源的天然藥物及其衍生物在對抗微生物感染中占據(jù)著很大的比例1。微生物在長期進(jìn)化中保留下來的抗生素具有很強的靶位點特異性和很高的生物活性2。近年來，抗生素的普遍使用在全球范圍內(nèi)導(dǎo)致一些具有抗生素抗藥性的人類致病菌的產(chǎn)生，給臨床治療帶來了新的挑戰(zhàn)3。而新批準(zhǔn)的抗生素大部分具有與原有抗生素相似的骨架結(jié)構(gòu)，極易造成靶向致病菌再次培育完善的抗藥機(jī)制以及抗生素的二次失效。較有名的實例包括ceftobiprole、daptomycin、tigecycline這些天然抗生素藥物在對多重抗藥性的金黃色葡萄球菌S.aureus和多重抗藥性的腸球菌Enterococci治療中的逐漸失效4。耐藥型致病菌株的快速傳播，已經(jīng)導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)能對抗多種抗生素的“超級細(xì)菌”，給病人帶來致命威脅。而擁有13億人口的中國是世界上濫用抗生素最為嚴(yán)重的國家之一，細(xì)菌整體耐藥率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國家。針對耐藥型致病菌株來研發(fā)新的抗生素目前變得刻不容緩。然而在全球抗生素資源短缺的同時，很多國際知名的制藥行業(yè)在近些年卻逐漸減少研發(fā)新型抗生素的投資，造成了抗生素供求關(guān)系矛盾的加劇。哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院著名天然產(chǎn)物學(xué)家Christopher T .Walsh教授指出，如果不增加抗生素的研發(fā)力度，人類對抗致病菌感染的能力將會迅速退化到抗生素發(fā)明之前的水平5。充分挖掘已有的抗生素主要來源菌細(xì)胞內(nèi)的次生代謝物資源、開發(fā)全新的抗生素菌種資源迫在眉睫6，7。人們從滑行細(xì)菌中分離得到很多生物活性物質(zhì)，部分顯示出良好的成藥性，進(jìn)入臨床試用階段。例如具有抗腫瘤活性的curacin A和抗金黃色葡萄球菌活性的TAN-1057A是具有良好開發(fā)前景的先導(dǎo)化合物8，9，抗腫瘤化合物epothilone和dolastatin10，11已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗期。

本文對分離自沿海潮間帶區(qū)域嗜麥芽窄食單胞菌進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析測試并進(jìn)行基因組成分析。通過比較已發(fā)表的嗜麥芽窄食單胞菌的基因序列，對代謝物較豐富的嗜麥芽窄食單胞菌P3-15的基因組進(jìn)行初步分析，獲取新穎聚酮合成酶-非核糖體多肽合成酶（PKS-NRPS）基因簇3個（圖1A，B，C），針對圖1A的基因簇設(shè)計引物并通過接合轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行基因簇敲除。本研究建立了嗜麥芽窄食單胞菌遺傳操作體系，并成功地對一新穎聚酮合成酶-非核糖體多肽合成酶進(jìn)行基因敲除。研究證實嗜麥芽窄食單胞菌具有基因敲除可操作性，能夠通過基因修飾獲取新穎代謝產(chǎn)物。

實驗方法：

1.采集渤海沿岸石油烴污染土壤（5厘米深度），以無菌蒸餾水清洗土壤并在1.5%幾丁質(zhì)的瓊脂糖平板上進(jìn)行篩選，將單克隆轉(zhuǎn)移至LB（含氨芐霉素、卡那霉素）液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行富集及進(jìn)一步篩選。通過堿裂解法提取單克隆總DNA，利用特異性引物進(jìn)行16SrRNA可變區(qū)擴(kuò)增，通過454測序分析獲取十二株菌株的16SrRNA組成。

2.選取代謝物較豐富的P3-15菌株進(jìn)行總DNA提取及細(xì)菌框架圖的測序分析（凌恩生物），獲取長度4.2Mb的總DNA序列。通過ANTI-SMASH分析獲得新穎聚酮合成酶-非核糖體多肽合成酶（PKS-NRPS）基因簇3個。設(shè)計引物（CATTAGCT ACAGCGCGCCGGACC/CAGTTACCGCATCAAGCCCATTAC）進(jìn)行靶序列PKS1擴(kuò)增（預(yù)期片段大?。?15bp）。

3.利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（天根生物PCR擴(kuò)增試劑盒）獲取200ngPKS1靶序列片段。培養(yǎng)大腸桿菌S17-1細(xì)胞（200毫升LB液體培養(yǎng)基），提取接合轉(zhuǎn)移載體pJQ200SK共200ng（圖2）（天根生物質(zhì)粒提取試劑盒）。采用SpeI及PstI雙酶切載體與PKS1序列（NOVOZYME），純化酶切片段達(dá)到50ng/l濃度。用不少于200ngPKS1與100ng載體在16°C連接過夜（12h）。冰上解凍100L大腸桿菌DH5細(xì)胞，在解凍的細(xì)胞液內(nèi)加入10l轉(zhuǎn)化液冰浴30分鐘，隨后42°C熱激90秒。繼續(xù)冰浴5分鐘后加入1ml無抗性LB液體培養(yǎng)基，37°C松弛培養(yǎng)60分鐘。在12300rpm轉(zhuǎn)速下離心1分鐘除去上清，將剩余細(xì)胞懸浮于約100l的無抗LB培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸浮液平鋪到LB（含100g/ml慶大霉素）固體平板培養(yǎng)基上，37°C生長16-24h（同時用不含PKS1的空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5細(xì)胞作為陰性對照）。將有抗性的單克隆轉(zhuǎn)移至10mlLB（含100g/ml慶大霉素）液體培養(yǎng)基中，37°C生長16-24h。對質(zhì)粒進(jìn)行小量制備及PCR驗證（圖1）。

4.對正確的PKS1-pJQ200SK載體進(jìn)行制備（100mlLB液體培養(yǎng)基），濃縮至200ng/ml。取2 l轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1（熱激法），挑取單克隆在10mlLB（含100g/ml慶大霉素）液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)至O.D.0.7，取1ml培養(yǎng)液進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。同時培養(yǎng)野生P3-15菌株至O.D.0.7，取1ml培養(yǎng)液進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。

5.將1mlS17-1及P3-15菌株離心，棄上清。將菌體懸浮于1ml100mg/L的硫酸鎂溶液中，12300rpm離心后棄全部上清。加入1ml硫酸鎂溶液繼續(xù)懸浮，再次離心后留約100l硫酸鎂溶液，將細(xì)胞懸浮后平鋪于1/10TSA（含100g/ml慶大霉素和25g/ml卡那霉素）固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)4-5天。

6.挑取具有抗性的單克隆在3ml1/10TSB（含100g/ml慶大霉素和25g/ml卡那霉素）培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)4-5天。提取單克隆總DNA并進(jìn)行PKS1片段的PCR驗證。

實驗結(jié)果：

1.P3-15的新穎聚酮合成酶-非核糖體多肽合成酶（PKS-NRPS）的antiSMASH生物信息學(xué)分析：

PKS合成基因簇及其他次級代謝產(chǎn)物相關(guān)的合成基因簇通常使用antiSMASH軟件進(jìn)行注釋12。對P3-15的antiSMASH注釋證實其基因組內(nèi)含有包括Bacteriocin、arylpolyene、未知Nrps等次級代謝產(chǎn)物合成基因簇（圖2）。針對圖2A中酮基合成酶序列設(shè)計引物，擴(kuò)增長度815bp的片段。

2.轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因型鑒定。對鑒定正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并獲取對數(shù)增長期細(xì)胞（O.D.0.5-0.6）。同時培養(yǎng)嗜麥芽窄食單胞菌至對數(shù)增長期。混合等體積的大腸桿菌S17-1和嗜麥芽窄食單胞菌細(xì)胞并涂布平板，采用慶大霉素和卡那霉素進(jìn)行抗生素篩選。28°C培養(yǎng)2-4天。挑取40個具有雙重抗生素抗性的單克隆進(jìn)行PCR驗證（918bp）（圖2）。通過抗生素篩選和PCR驗證，#3號克隆的基因組模板擴(kuò)增產(chǎn)生與預(yù)期擴(kuò)增大小相同的條帶，是正確的重組子。

圖2：接合轉(zhuǎn)移子的PCR驗證：選取同源重組區(qū)域外源的DNA片段作為設(shè)計引物的序列參考，對重組子進(jìn)行基因型的驗證。預(yù)期條帶大?。?18bp（藍(lán)箭頭）。

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