潘莎莎 陶翎 郭睿 惲衛(wèi)東 朱棟 楊健 李幸 徐燕妮 鄒海強(qiáng) 汪慶燕 周翔

（常州千紅生化制藥股份有限公司 江蘇常州 213125）

1 前言

肝素鈉是一種來自豬小腸黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖藥物，屬粘多糖類物質(zhì)。作為源自天然成分的抗凝藥主要用于防止血栓形成或深靜脈血栓的治療。臨床使用中，由于存在發(fā)生肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥（heparin-induced thrombocytopenia，HIT）的風(fēng)險(xiǎn)[1]，會(huì)嚴(yán)重威脅患者生命安全，所以對(duì)肝素產(chǎn)品免疫原性的評(píng)估和管理非常重要。因肝素作為來源于豬等動(dòng)物的生化藥物，可能在肝素原材料如器官采集、切割、初產(chǎn)品加工等前道工序中混入不定量的脂類物質(zhì)，而脂質(zhì)作為雜質(zhì)的一種，可能會(huì)作為免疫激動(dòng)劑增強(qiáng)肝素的免疫原性[2]。因此本文建立一種針對(duì)肝素鈉中脂質(zhì)含量的檢測方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

脂質(zhì)不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。測定脂質(zhì)大多采用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑萃取的方法。常用的溶劑有乙醚，石油醚等。國內(nèi)外藥典（Ch.P.、USP等）中對(duì)于脂質(zhì)的測定，均采用有機(jī)溶劑萃取，取有機(jī)層，將有機(jī)溶劑揮發(fā)干后，恒重稱量，測得樣品中脂質(zhì)含量。因此，對(duì)于肝素中脂質(zhì)的含量測定，以石油醚為提取劑采用索式提取法提取肝素中脂質(zhì)后恒重稱量的方法能符合肝素中脂質(zhì)的檢測要求。根據(jù)中國藥典2015版二部附錄XIX A《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》、ICH Q2B《Validation of Analytical Procedures：Methodology》以及USP33-NF28<1225>《Validation of Compendial Procedures》對(duì)該方法進(jìn)行范圍、準(zhǔn)確度、精密度和檢測限的驗(yàn)證。

2 方法原理

脂質(zhì)不溶于水，將經(jīng)干燥后的供試品用石油醚回流提取，使供試品中的脂質(zhì)進(jìn)入溶劑中，蒸去溶劑后所得到的殘留物，即為脂質(zhì)。

3 儀器與試劑

天平（AB265-S，H020）；真空干燥箱（VD23，S136）；索式提取器；單標(biāo)線吸管；刻度吸管。

肝素鈉（注射級(jí)，常州千紅生化制藥股份有限公司18110211007）；石油醚（沸程30℃～60℃，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司F20101014）；脂質(zhì)（天津天源脂質(zhì)有限公司15907）。

4 供試品分析的測定程序

（1）濾紙筒的制備：將8 cm×15 cm大小的濾紙，用直徑約2 cm的試管為模型，將濾紙以試管壁為基礎(chǔ)，折疊成底端封口的濾紙筒，筒內(nèi)底部放一小片脫脂棉，置于干燥器中備用。

（2）樣品處理：精密稱取干燥并研細(xì)的樣品5.000 g，無損的移入濾紙筒內(nèi)。

（3）抽提：將濾紙筒放入索氏抽提器內(nèi)，連接已干燥至恒重的脂質(zhì)接收瓶，由冷凝管上端加入石油醚，加量為接收瓶的2/3體積，于水浴上加熱使石油醚不斷的回流提取3 h。

（4）稱重：取下接收瓶，在水浴上蒸干，再于60℃真空干燥箱內(nèi)干燥2 h，取出放干燥器內(nèi)冷卻30 min，稱重，并重復(fù)操作至恒重。

（5）脂質(zhì)結(jié)果計(jì)算公式為：

（ppm）＝（m2－m1）/m×106

式中：m2為接受瓶和脂質(zhì)的質(zhì)量，g；m1為接受瓶的質(zhì)量，g；m為樣品的質(zhì)量，g。

5 可接受標(biāo)準(zhǔn)

（1）范圍：回收率均介于90%～110%之間。

（2）準(zhǔn)確度：回收率均介于90%～110%之間。

（3）精密度：①重復(fù)性：相對(duì)平均偏差<5%。②中間精密度：實(shí)驗(yàn)員2日內(nèi)自身測定結(jié)果相相對(duì)平均偏差<5%，實(shí)驗(yàn)員之間測定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<5%。

（4）檢測限：當(dāng)回收的脂質(zhì)的量大于天平稱量不確定度的3倍但小于其5倍時(shí)，該添加的脂質(zhì)的量即為該檢驗(yàn)方法的檢測限；相對(duì)平均偏差<5%。

6 驗(yàn)證結(jié)果

6.1 空白試驗(yàn)

（1）精密稱取肝素鈉供試品2份，每份5.000 g，無損地移入干燥濾紙筒內(nèi)，將濾紙筒放入索氏抽提器內(nèi)，依法測定，計(jì)算出空白值（＝抽提后已恒重得接受瓶質(zhì)量－抽提前恒重的接收瓶的質(zhì)量），見表1。

表1 肝素鈉供試品空白實(shí)驗(yàn)

（2）結(jié)論：5.000 g肝素鈉樣品的空白測得值為0.04 mg。

6.2 范圍

（1）精密稱取肝素鈉供試品5份，每份5.000 g，無損地移入干燥濾紙筒內(nèi)，將濾紙筒放入索氏抽提器內(nèi)，分別加入含0.5 mg/ml的脂質(zhì)的石油醚溶液（精密稱取脂質(zhì)500.0 mg，置于100 ml容量瓶中，用石油醚定容至100.0 ml，精密吸取上述溶液10.0 ml置100 ml容量瓶中，用石油醚定容至100.0 ml）1.5、1.3、1.0、0.7和0.5 ml，使得脂質(zhì)的添加量分別為150、130、100、70和50 ppm。待有機(jī)溶劑揮發(fā)干后，依法測定，每份平行測定二次，計(jì)算出回收的脂質(zhì)的量（扣除空白值），除以加入脂質(zhì)的理論值，計(jì)算回收率。

（2）測定結(jié)果見表2。

表2 肝素鈉供試品測定結(jié)果

（3）結(jié)論：定量加入1.5、1.3、1.0、0.7和0.5 ml含0.5mg/ml脂質(zhì)的石油醚溶液，測得的平均回收率分別為94.6%、93.8%、94.0%、92.8%和96.0%，回收率均介于90%～110%之間，符合規(guī)定。

6.3 準(zhǔn)確度

（1）精密稱取肝素鈉供試品3份，每份5.000 g，無損地移入干燥濾紙筒內(nèi)，將濾紙筒放入索氏抽提器內(nèi)，分別加入含0.5 mg/ml脂質(zhì)的石油醚溶液1.2、1.0和0.8ml，使得脂質(zhì)的添加量分別為120、100和80 ppm，待有機(jī)溶劑揮發(fā)干后，依法測定，每份平行測定二次，計(jì)算出回收的脂質(zhì)的量（扣除空白值），除以加入脂質(zhì)的理論值，求出回收率。

（2）測定結(jié)果見表3。

表3 肝素鈉供試品的回收率

（3）結(jié)論：定量加入1.2、1.0和0.8ml含0.5mg/ml脂質(zhì)的石油醚溶液，測得的平均回收率分別為94.2%、93.0%、93.8%，均介于90%～110%之間，符合規(guī)定。

6.4 精密度

6.4.1 重復(fù)性

（1）精密稱取肝素鈉供試品5.000 g，無損地移入干燥濾紙筒內(nèi)，將濾紙筒放入索氏抽提器內(nèi)，加入含0.5 mg/ml脂質(zhì)的石油醚溶液1.0 ml，使得脂質(zhì)的添加量分別為100 ppm，待有機(jī)溶劑揮發(fā)干后，依法測定，平行測定6次，計(jì)算出回收的脂質(zhì)的量（扣除空白值），除以加入脂質(zhì)的理論值，求出回收率，計(jì)算回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

（2）測定結(jié)果見表4。

表4 肝素鈉供試品回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

（3）結(jié)論：脂質(zhì)回收率的RSD為3.2%，<5%，符合規(guī)定。

6.4.2 中間精密度

（1）由2名實(shí)驗(yàn)人員，在2日內(nèi)，對(duì)同一批肝素鈉供試品按重復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，平行測定2份，計(jì)算回收率，然后計(jì)算該測定結(jié)果的相對(duì)平均偏差。

（2）測定結(jié)果見表5。

表5 肝素鈉供試品的相對(duì)平均偏差

（3）結(jié)論：實(shí)驗(yàn)員A脂質(zhì)回收率測定結(jié)果相對(duì)平均偏差為2.1%，實(shí)驗(yàn)員B脂質(zhì)回收率測定結(jié)果相對(duì)平均偏差為1.1%，均<5%，符合規(guī)定；實(shí)驗(yàn)員A和實(shí)驗(yàn)員B脂質(zhì)回收率測定結(jié)果RSD為2.0%，<5%，符合規(guī)定。

6.5 檢測限

（1）精密稱取肝素鈉供試品5.000 g，無損地移入干燥濾紙筒內(nèi)，將濾紙筒放入索氏抽提器內(nèi)，分別加入含0.5 mg/ml脂質(zhì)的石油醚溶液（配制記錄見范圍試驗(yàn)）1.0、0.7和0.5 ml，使得脂質(zhì)的添加量為100、70和50 ppm，待有機(jī)溶劑揮發(fā)干后，依法測定，平行測定2份，計(jì)算出回收的脂質(zhì)的量（扣除空白值）。將空的已恒重接收瓶置于天平上重復(fù)稱量10次，求出該天平的稱量不確定度（10次測定數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差）。

（2）測定結(jié)果見表6、表7。

表6 肝素鈉供試品的不確定度

表7 肝素鈉供試品的檢測限測定

其中，3倍不確定度為0.18 mg，5倍不確定度為0.30 mg。

按測得的檢測限的量（0.25 mg）進(jìn)行回收試驗(yàn)，依法測定，平行測定2次，計(jì)算相對(duì)平均偏差，見表8。

表8 肝素鈉供試品的回收試驗(yàn)

（3）結(jié)論：上述脂質(zhì)含量為50 ppm時(shí)，回收的脂質(zhì)的量大于天平稱量不確定度的3倍但小于其5倍，該添加的脂質(zhì)的量即為該檢驗(yàn)方法的檢測限；相對(duì)平均偏差為4.2%，符合規(guī)定。

7 結(jié)論

綜上所述，本方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，脂質(zhì)含量檢測限為50 ppm，脂質(zhì)含量在50 ppm～150 ppm范圍內(nèi)回收率符合要求，可用于本公司肝素中脂質(zhì)含量的檢驗(yàn)。