基于高通量測序的窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)及其理化因子相關(guān)性分析

張明珠，吳學(xué)鳳，穆冬冬，許博陽，孫 偉，蔣俊樹，閆曉明，鄭 志，姜紹通，李興江,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽文王釀酒股份有限公司，安徽 臨泉 236400；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽 合肥 230001；4.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，因為其獨(dú)特的發(fā)酵工藝和風(fēng)味而享譽(yù)全球[1-2]。我國白酒的釀造歷史悠久，以富含淀粉的糧谷類為主要原料，大曲、小曲或麩曲作為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)（少數(shù)采用液態(tài)或半固態(tài)）進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)蒸餾、貯存和勾調(diào)而成[3-4]。安徽地區(qū)流行喝高度白酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)主要在42%～53%之間），口味以濃香型為主[5]。安徽地產(chǎn)白酒以古井、金種子、迎駕和文王為代表，均屬于濃香型白酒[6]。濃香型白酒的釀造過程是環(huán)境微生物、大曲微生物和窖泥微生物等復(fù)雜物質(zhì)能量代謝的過程[7]，加入大曲的糧糟在窖池內(nèi)糖化，依賴于窖池中各種微生物群落的功能和作用完成釀造過程[8]。因此，窖泥中的微生物種類、數(shù)量繁多且復(fù)雜[9-10]。窖泥經(jīng)過長期、連續(xù)的生產(chǎn)，不斷形成其獨(dú)特優(yōu)質(zhì)的微生物群落，這些微生物菌群代謝產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，例如酯、酸和醇[11-12]，并最終形成對酒質(zhì)的提高及穩(wěn)定至關(guān)重要的優(yōu)質(zhì)老窖泥[13]，正所謂“千年老窖萬年糟，酒好全憑窖池老”[14]。

近年來，隨著微生物組學(xué)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使窖泥中蘊(yùn)含的厭氧微生物科學(xué)奧秘逐步得以剖析。研究發(fā)現(xiàn)，這些微生物之間及與環(huán)境因子的相互作用，形成了復(fù)雜的窖泥微生物生態(tài)系統(tǒng)[15]。但具體窖泥中的理化因子與哪些菌群存在怎樣的相互作用關(guān)系，仍鮮有研究報道。目前對安徽產(chǎn)地濃香型白酒方面的研究，對古井貢酒的研究較多，而對其他品牌的濃香型白酒，如文王貢酒的研究較少。本研究通過對安徽文王白酒窖泥的理化特性與其微生物之間的相關(guān)性進(jìn)行研究分析，試圖揭示各種理化指標(biāo)對窖泥微生物群落組成的影響，以期為進(jìn)一步提高白酒風(fēng)味品質(zhì)提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自文王酒廠2、20 a和30 a窖齡窖池窖泥[16]。采樣方法：池底泥采用五點取樣法，從窖池池底4 個角和中心點取樣混合，作為池底窖泥（2 a窖池：BPM_2；20 a窖池：BPM_20；30 a窖池：BPM_30）。池壁窖泥是從窖池的上中下層取樣混合，作為池壁泥樣品（2 a窖池：WPM_2；20 a窖池：WPM_20；30 a窖池：WPM_30），每個樣品取3 份，所取樣品每份約400 g。

納氏試劑 上海源葉生物科技有限公司；酒石酸鈉鉀、氯化銨、氯化鈉、硫酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵（均為分析純） 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；鄰菲啰啉 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；VARIAN AA240原子吸收光譜儀美國瓦里安中國有限公司；MiSeqPE300 美國Illumina公司；DNeasy PowerSoil DNA分離試劑盒美國Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將采集樣品置于無菌袋中充分混勻后分成2 份，分別置于4 ℃冰箱（測定理化指標(biāo)）和-80 ℃冰箱（窖泥DNA的提?。?。將新鮮的窖泥樣品平攤在瓷盤中，自然風(fēng)干，風(fēng)干后研磨成粉，通過60 目篩，保存在磨口瓶中。銨態(tài)氮在風(fēng)干過程中易變化，需用新鮮的泥樣測定，同時測定水分，以換算為風(fēng)干樣的含量。

1.3.2 基因組DNA的提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和高通量測序

窖泥微生物總基因組DNA利用DNeasy PowerSoil DNA分離試劑盒進(jìn)行提取，提取方法按照試劑公司提供的實驗操作指南進(jìn)行。然后利用1%瓊脂糖電泳對提取的窖泥微生物DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，并保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

16S rDNA擴(kuò)增子測序的引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）與806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），擴(kuò)增為16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）純化PCR產(chǎn)物，并通過QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega，Madison，WI，USA）檢測定量PCR產(chǎn)物濃度，最后在Illumina MiSeq測序平臺對PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行雙端測序（2×300 bp；Illumina MiSeq PE300，San Diego，CA，USA），建庫與測序在上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.3 窖泥理化因子分析

水分含量測定：采用常壓干燥法[17]；pH值：參照Tao Yong等[18]的方法，將窖泥經(jīng)水提取后，用pH計測定；銨態(tài)氮含量：采用紫外-可見光分光光度法測定[19]；有效磷、速效鉀、腐殖質(zhì)、鈣含量：采用原子吸收光譜法，由安徽國科檢測科技有限公司測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列由Flash和Fastp軟件進(jìn)行拼接和質(zhì)控過濾。序列的檢驗標(biāo)準(zhǔn)：1）過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads。2）根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小overlap長度為10 bp。3）拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列。4）根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。使用Uchime軟件除去嵌合序列。使用Usearch（version 7.0，http://drive5.com/uparse/）將序列按照97%的相似性聚類，進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），提取代表序列，并獲得OTU表。細(xì)菌OTU代表序列與Silva（Release132，http://www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫比對，進(jìn)行分類學(xué)注釋，并計算Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)及文庫覆蓋率。采用Circos-0.67-7（http://circos.ca/）分析窖泥與微生物菌群的關(guān)系，采用R（pheatmap包）分析窖泥環(huán)境因素變化與細(xì)菌群落的相關(guān)性[20-22]。采用Origin 2018 64Bit、SPSS 21和Cytoscape 3.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖池窖泥理化因子分析

2.1.1 不同年份窖池窖泥樣品中理化因子含量差異

從表1可以看出，BPM_20和WPM_20的水分含量（（44.68±0.60）%和（46.55±0.05）%）稍高于BPM_30、WPM_30和BPM_2、WPM_2，且差異顯著。BPM_30、WPM_30和BPM_2、WPM_2之間無顯著性差異。但一般認(rèn)為成熟窖泥的水分含量介于40%～50%之間，并且其含量會直接影響窖泥的pH值、腐殖質(zhì)、微生物區(qū)系及其生長狀況[23-24]。由此可見，窖泥樣品的水分含量均屬正常范圍。BPM_2、WPM_2、BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30的pH值均有顯著性差異（P＜0.05），其中池壁窖泥的pH值普遍低于池底窖泥，酸性更強(qiáng)，與任道群[25]和孟雅靜[26]等研究的池底泥pH值大于池壁泥pH值結(jié)果一致。并且不同年份窖池的窖泥之間pH值差距也較大，整體階段的pH值呈現(xiàn)出逐漸升高后又緩慢降低，最后趨于穩(wěn)定（5.67±0.03和4.92±0.05）。廖昶等[27]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)膒H值不但能促進(jìn)乙醇發(fā)酵，而且還有利于產(chǎn)香前體物質(zhì)的形成，提高原酒質(zhì)量。銨態(tài)氮是微生物自身繁殖、合成各種蛋白質(zhì)以及酶類所必需的物質(zhì)，適量的銨態(tài)氮對維持窖泥生境，提高酒質(zhì)有著重要作用[28]。由表1發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮含量與不同年份窖池窖泥pH值變化呈現(xiàn)出類似規(guī)律，池底窖泥的銨態(tài)氮含量普遍高于池壁窖泥，差異顯著（P＜0.05）。但BPM_20和BPM_30差異不顯著。此外，在對有效磷和速效鉀的分析中發(fā)現(xiàn)，BPM_2和WPM_2中有效磷的含量顯著低于BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30。BPM_20和WPM_20之間也存在著一定的差異。速效鉀的含量變化趨勢和窖泥中有效磷的含量變化趨勢基本一致，都呈現(xiàn)出逐漸上升，然后緩慢下降，最后趨于穩(wěn)定的趨勢。并且不同階段窖池的各窖泥樣品之間都存在顯著性差異（P＜0.05）。這可能是因為有效磷是細(xì)菌與真菌分泌分解植酸酶作用后生成[29]，并且與有效磷含量與土壤中微生物生物量及代謝呈正相關(guān)[30]。窖泥中的速效鉀主要是指水溶性鉀，是微生物可以利用的鉀元素[31]，窖泥中適量速效鉀有利于窖泥微生物的生長繁殖。這也與窖泥樣品與菌群關(guān)系的結(jié)果一致，20 a和30 a窖泥樣品中微生物多樣性顯著高于2 a的窖泥樣品。窖泥的鈣含量與其他理化因子含量存在很大不同，BPM_2和WPM_2中鈣含量最高與其他窖泥樣品具有顯著性差異，在窖泥老熟過程中鈣含量逐漸降低并趨于穩(wěn)定。這可能是因為新的發(fā)酵窖泥中鈣含量較高，隨著窖池的老熟，窖池窖泥中己酸菌得到富集，窖泥中的鈣不斷被利用最后達(dá)到動態(tài)平衡[28]。窖泥中腐殖質(zhì)含量的變化沒有呈現(xiàn)出與不同年份之間的規(guī)律性，BPM_2和WPM_2的腐殖質(zhì)含量差異顯著，但BPM_30和WPM_30中腐殖質(zhì)含量無顯著性差異，含量趨于穩(wěn)定值。劉梅等[32]也發(fā)現(xiàn)雖然在窖泥當(dāng)中腐殖質(zhì)需要達(dá)到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但是其與窖泥品質(zhì)的變化并不存在規(guī)律性。

表1 不同年份窖池池底泥和池壁泥的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of bottom pit mud and wall pit mud from pits of different ages

窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用，并且窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣與窖池窖齡的相關(guān)性是一個動態(tài)變化的過程，首先新窖泥逐步老熟，形成優(yōu)質(zhì)窖泥，再從優(yōu)質(zhì)窖泥逐漸退化。先前的研究發(fā)現(xiàn)新窖泥和退化窖泥與優(yōu)質(zhì)窖泥相比，具有低含水量、低pH值和低有效磷的特征[26,33]，因此，可以通過窖泥的理化指標(biāo)合理判斷窖泥的質(zhì)量優(yōu)劣?？傮w來看，20 a窖泥的水分含量、pH值、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量都顯著高于2 a窖泥（P＜0.05），但2 a窖泥中的鈣含量卻是20 a窖泥的2.17～2.32 倍，由此也可以合理推斷，窖泥在2～20 a是一個從新窖泥逐漸老熟到優(yōu)質(zhì)窖泥的過程，窖泥的水分含量、pH值、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量都與窖齡呈正相關(guān)，但窖泥的鈣含量則與窖齡呈負(fù)相關(guān)。王春艷等[34]比較分析了6 a和16 a窖泥的理化指標(biāo)時發(fā)現(xiàn)，隨著窖齡的增加，窖泥的pH值、水分、銨態(tài)氮和有效磷等含量均呈現(xiàn)增長的趨勢，與本研究結(jié)果一致。而從20～30 a，窖泥開始退化，但退化的速度較為緩慢，因此僅有水分含量、pH值和銨態(tài)氮含量具有顯著性差異（P＜0.05），而其他理化指標(biāo)均無顯著性差異（P＞0.05），此時窖泥的水分含量、pH值和銨態(tài)氮含量則與窖齡呈負(fù)相關(guān)，而其他的理化指標(biāo)則無明顯相關(guān)性。綜合比較30 a窖泥和2 a窖泥發(fā)現(xiàn)，其pH值、銨態(tài)氮和有效磷含量均顯著高于2 a窖泥（P＜0.05），但其鈣含量僅為2 a窖泥的0.57～0.61 倍。

2.1.2 窖泥理化指標(biāo)主成分分析（principal component analysis，PCA）

窖泥樣品理化指標(biāo)提取到的PC1和PC2特征值分別是4.72和1.13，均大于1，累計方差貢獻(xiàn)率為83.43%，說明成分劃分合理。如圖1所示，按照PC1和PC2的劃分，水分含量、銨態(tài)氮和pH值、有效磷、速效鉀和腐殖質(zhì)集中在同一區(qū)域，鈣含量單獨(dú)占據(jù)一區(qū)域。這些理化因子能夠為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)和其生長代謝必不可少的元素，與微生物的生長密切相關(guān)。因此，在同一區(qū)域的理化因子含量變化的基本趨勢一致，僅有鈣含量與其他理化因子不同，這與之前對理化指標(biāo)含量差異的分析結(jié)果一致。因此按照PC1和PC2劃分出的理化指標(biāo)具有一定的科學(xué)性。

圖1 窖泥樣品理化指標(biāo)PCA圖Fig.1 Principal component analysis plot of PC1 versus PC2 for physicochemical indexes

2.2 窖泥理化因子與窖泥菌群相關(guān)性研究

2.2.1 窖泥樣品原核微生物α多樣性指數(shù)與OTU數(shù)目比較分析

如表2所示，每個窖泥樣品序列數(shù)介于32 029～44 916 條，其中20 a和30 a窖泥的序列數(shù)量顯著高于2 a窖泥，但其在不同位置窖泥之間無顯著差異（P＞0.05）。從窖泥樣品物種豐富度（Sob指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)）、多樣性（Shannon指數(shù)）、均勻度（Simpson指數(shù)）及覆蓋率可以看出，老窖泥當(dāng)中的微生物群落更豐富，多樣性更高，這表明窖泥原核微生物群落的α多樣性存在顯著的時間異質(zhì)性，并且在20～30 a這個過程當(dāng)中，窖泥質(zhì)量開始呈現(xiàn)退化趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)Shannon指數(shù)與窖泥質(zhì)量呈正相關(guān)，能很好地反映窖泥老熟和退化程度[10,35]，20 a窖泥的Shannon指數(shù)顯著高于2 a窖泥，30 a窖泥的微生物多樣性與其相比也有降低的趨勢，這也很好地反映了窖泥老熟和退化的過程。

表2 不同年份窖泥樣品原核微生物群落α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of prokaryotic community in pit mud samples of different ages

如圖2a所示，BPM_20中的OTU數(shù)目最多，并且不同窖泥樣品中特有OTU及其總含量分別為28和9.52%（BPM_2）、26和14.20%（WPM_2）、28和21.15%（BPM_20）、30和19.13%（WPM_20）、5和15.23%（BPM_30）、23和20.76%（WPM_30）。2 a的30 a的窖泥樣品中，池壁窖泥的OTU數(shù)目均高于池底窖泥，但是在20 a窖泥當(dāng)中，其池底窖泥的微生物多樣性更高，這表明在優(yōu)質(zhì)窖泥當(dāng)中，池底窖泥的微生物種類更加豐富。并且由圖2b可知，池壁窖泥的OTU種類和數(shù)目均高于池底窖泥，并且其特有OTU含量也更高（113，14.66%），這主要來源于2 a和30 a池壁窖泥樣品較高的相對含量比，這也表明在新窖泥和即將退化的池壁窖泥當(dāng)中存在一些影響窖泥質(zhì)量的微生物菌群，而這些菌群具體是哪些，還需要進(jìn)一步的分析研究。

圖2 不同窖泥樣品（a）和池壁窖泥和池底窖泥中OTU水平Venn圖（b）Fig.2 Venn diagram of OTUs in pit mud samples of different ages (a) and those in bottom vs.wall pit muds (b)

2.2.2 窖泥樣本與菌群組成關(guān)系分析

從圖3a可以看出，共有6 個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、放線菌門（Actinobacteria）、Patescibacteria和軟壁菌門（Tenericutes）。在2 a的窖泥樣品中僅發(fā)現(xiàn)1 個優(yōu)勢菌門Firmicutes（BPM_2和WPM_2中平均相對豐度大于0.1%），在20 a和30 a的窖泥中發(fā)現(xiàn)4 個優(yōu)勢菌門（Firmicutes、Bacteroidetes、Synergistetes、Actinobacteria；BPM_20、WPM_20和BPM_30、WPM_30中平均相對豐度大于0.1%）。同時發(fā)現(xiàn)Firmicutes在不同窖齡的窖泥當(dāng)中含量存在很大差異，由高到低依次為Firmicutes（BPM_2，99.49%；WPM_2，99.75%）＞Firmicutes（BPM_30，77.30%；WPM_30，84.88%）＞Firmicutes（BPM_20，54.26%；WPM_20，65.67%）。Firmicutes的相對豐度在窖泥逐漸老熟到開始退化的過程中呈現(xiàn)出一種先降低后增加的趨勢，Tao Yong等[18]的研究也與本實驗結(jié)果一致。另外在屬水平上，共發(fā)現(xiàn)25 個菌屬（圖3b），其中在2 a的窖泥樣品中仍是僅有1 個優(yōu)勢菌屬乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（BPM_2和WPM_2中平均豐度含量大于0.1%），并且2 a窖泥的Lactobacillus的相對豐度顯著高于20 a和30 a的老窖泥，因此可以看出Lactobacillus含量與窖泥質(zhì)量呈一定負(fù)相關(guān)，而2 a窖泥中較低的pH值，也為Lactobacillus創(chuàng)造了更為有利的生長條件。分別在20 a和30 a的窖泥中發(fā)現(xiàn)15 個和17 個優(yōu)勢菌屬（BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30中平均相對豐度大于0.1%）。由此可見，BPM_2和WPM_2中Lactobacillus占據(jù)絕對優(yōu)勢地位，菌群種類單一，BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30中各種菌群分布均勻且種類豐富。由此可見，不同的窖泥樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)仍存在較大差異，胡曉龍[16]研究發(fā)現(xiàn)也證實了本實驗結(jié)果。

圖3 不同年份窖泥樣品與菌群關(guān)系門水平（a）和屬水平（b）Circos圖Fig.3 Circos diagram for microflora structure in pit mud samples of different years at phylum (a) and genus level (b)

2.2.3 窖泥理化因子與菌群的相關(guān)性分析

由圖4可知，水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量與Lactobacillus呈極顯著負(fù)相關(guān)。并且pH值與瘤胃梭菌屬（Ruminiclostridium）、Fermentimonas和Caldicoprobacter等17 個菌屬呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。水分含量與Petrimonas、互養(yǎng)單胞菌屬（Syntrophomonas）和Sedimentibacter等11 個菌屬顯著正相關(guān)（P＜0.05）。銨態(tài)氮含量與Fermentimonas、Ruminiclostridium和Petrimonas等9 個菌屬顯著正相關(guān)（P＜0.05）。而腐殖質(zhì)含量與Petrimonas、Syntrophomonas和Hydrogenispora等5 個菌屬呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。有效磷和速效鉀均與Anaerocella呈顯著性正相關(guān)，與其他少數(shù)菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），因此有效磷和速效鉀聚集為一簇。鈣含量與其他理化指標(biāo)不同，它僅與熱微菌屬（Tepidimicrobium）等4 個菌屬顯著正相關(guān)，與其他菌屬均無顯著相關(guān)，這也是其單獨(dú)聚為一簇的原因。這也與圖4中理化指標(biāo)的PCA結(jié)果一致。另外根據(jù)圖4也可以直觀地看出pH值、水分含量和銨態(tài)氮分別與屬水平總豐度前30物種當(dāng)中的18、12、10 個菌屬具有顯著相關(guān)性，因此這3 個環(huán)境因子對菌群的影響最大。劉梅等[32]也發(fā)現(xiàn)pH值和銨態(tài)氮對窖泥微生物群落的影響較大，銨態(tài)氮可以被窖泥微生物直接利用，其含量在一定程度上體現(xiàn)了窖泥對微生物生長代謝所需氮源的供給能力[36]，但是其含量并不是越多越好，窖泥當(dāng)中不同的微生物菌群對養(yǎng)分的響應(yīng)程度不同，因此酒廠需要合理的工藝方法調(diào)整營養(yǎng)物質(zhì)的含量，平衡微生物的群落結(jié)構(gòu)。弱酸性環(huán)境是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件，在發(fā)酵過程中對產(chǎn)酸和產(chǎn)酯具有重要作用[37]，因此窖泥的pH值會顯著影響窖泥微生物自身的繁殖及其參與的生化反應(yīng)。

圖4 窖泥理化因子與菌群相關(guān)性熱圖Fig.4 Heatmap of correlation between pit mud physicochemical indexes and microflora

從圖5可以看出，樣品理化指標(biāo)中pH值、水分含量、銨態(tài)氮含量對微生物群落的影響較為相似，并且影響程度較大，其次是有效磷含量、腐殖質(zhì)含量和鈣含量。在總豐度排名前5的物種中，發(fā)現(xiàn)瘤胃菌科（Ruminococcaceae），與30 a窖池的窖泥有很強(qiáng)的正相關(guān)。鞭毛科（Dysgonomonadaceae）、梭菌科（Clostridiaceae_1）和互養(yǎng)菌科（Synergistaceae）與20 a窖池的窖泥樣本有較高相關(guān)性，而乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）則主要存在于2 a窖池的窖泥樣本中。并且20 a和30 a的老窖泥樣本聚集在一簇，而2 a的新窖泥單獨(dú)聚集于一簇。與此同時，發(fā)現(xiàn)BPM_2和WPM_2樣本分布幾乎重合，而BPM_20、BPM_30和WPM_20、WPM_30分布范圍較廣，這也進(jìn)一步說明老窖泥當(dāng)中的微生物多樣性更高，新窖泥當(dāng)中的微生物組成更為單一。對于Dysgonomonadaceae、Clostridiaceae_1和Synergistaceae，可以看出水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量和腐殖質(zhì)含量與其呈正相關(guān)；對于Ruminococcaceae，可以看出鈣含量與其呈正相關(guān)，而有效磷、速效鉀含量與其呈負(fù)相關(guān)。更為明顯的是水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量和腐殖質(zhì)含量均與Lactobacillaceae呈負(fù)相關(guān)。冗余分析（redundancy analysis，RDA）的實驗結(jié)果印證了理化指標(biāo)中的水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量對細(xì)菌存在較大的相關(guān)性，反映了不同年份窖泥樣品中細(xì)菌微生物群落的差異性。

圖5 窖泥理化指標(biāo)和微生物群落冗余分析結(jié)果（科水平）Fig.5 Redundancy analysis of physicochemical indexes and microbial community in pit mud at family level

從圖6a可以看出，銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀和鈣含量這4 項理化指標(biāo)都僅與1 個微生物菌屬存在高度相關(guān)性（P＜0.01）。而水分含量與Lactobacillus呈高度負(fù)相關(guān)，與其他Aminobacterium、Sedimentibacter和Syntrophomonas等5 個屬的菌群均為高度正相關(guān)；pH值與Lactobacillus呈高度負(fù)相關(guān)，與其他Ruminiclostridium、Proteiniphilum和Caldicoprobacter等8 個屬的菌群呈高度正相關(guān)；腐殖質(zhì)與Petrimonas和Syntrophomonas均呈高度正相關(guān)。由圖6b可知，共線性網(wǎng)絡(luò)共有12 個節(jié)點（2 對負(fù)相關(guān)，10 對正相關(guān)），其中pH值對50.00%的菌門都具有高度相關(guān)，水分含量和銨態(tài)氮含量對16.67%的菌門具有顯著相關(guān)，而速效鉀僅與1 個菌門具有高度相關(guān)。綜合來看，pH值對微生物菌群的影響最大，范圍最廣。Belenguer等[38]也發(fā)現(xiàn)乳酸和丁酸水平與pH值密切相關(guān)，土壤pH值降低往往會降低微生物整體多樣性并改變原核生物群落的組成。此外，窖泥中呈負(fù)相關(guān)的微生物主要發(fā)生在Lactobacillus屬和Firmicutes門，2 a窖泥中Lactobacillus屬產(chǎn)生大量乳酸，乳酸積累使窖泥的pH值下降，因此Lactobacillus和pH值可以作為衡量窖泥質(zhì)量的重要指標(biāo)。

圖6 窖泥理化指標(biāo)和微生物菌群高度相關(guān)性分析屬水平（a）和門水平（b）共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Co-occurrence network diagram showing high correlation between pit mud physicochemical indexes and microbial flora at genus (a) and phylum (b) level

3 結(jié) 論

本研究通過分析2、20 a和30 a窖池池壁泥與池底泥的理化性質(zhì)和原核菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)：1）2 a窖池的窖泥均具有顯著的低pH值（4.28、3.99）、低有效磷（13.96、16.95 mg/kg）和高鈣含量（1.76、1.67 g/kg）的特征。2）20 a和30 a的老窖泥當(dāng)中微生物群落更豐富，多樣性更高。在門水平上，老窖泥中發(fā)現(xiàn)6 個優(yōu)勢菌門，而2 a窖泥中僅Firmicutes一個優(yōu)勢菌門。在屬水平上，2 a窖泥中Lactobacillus屬占絕對的優(yōu)勢低位，菌屬種類單一，20 a和30 a的老窖池中分別有15 個和17 個優(yōu)勢菌屬，菌屬多樣性程度高。3）RDA發(fā)現(xiàn)新窖池的池壁窖泥與池底窖泥聚類較為集中，而老窖池當(dāng)中的聚類較為分散，進(jìn)一步說明了老窖泥原核菌群的豐度和多樣性要高于新窖泥。4）理化因子與菌群的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，pH值、水分含量和銨態(tài)氮分別與屬水平總豐度前30物種當(dāng)中的18、12 個和10 個菌屬具有顯著相關(guān)性，通過RDA也發(fā)現(xiàn)水分含量（60.77%）和pH值（49.62%）對相關(guān)性的解釋度最高，具有極顯著貢獻(xiàn)（P＜0.01），銨態(tài)氮的解釋度為33.91%，具有顯著貢獻(xiàn)（P＜0.05），因此這3 個環(huán)境因子對菌群的影響最大。

綜上，本實驗系統(tǒng)地研究了部分不同品質(zhì)窖泥主要理化指標(biāo)的差異并進(jìn)行PCA，結(jié)合窖泥原核微生物群落多樣性在窖泥老熟及退化過程中的變化趨勢，以及窖泥理化指標(biāo)與微生物菌群的相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著窖泥年份的增加，窖泥老熟，在長期的往復(fù)發(fā)酵過程中，微生物不斷富集，進(jìn)化，并衍生出更多的種群。窖泥的理化因子和微生物多樣性指數(shù)均可以作為判斷窖泥優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)，本研究借助微生物和理化因子之間的相關(guān)性分析，為窖池的養(yǎng)護(hù)機(jī)制及優(yōu)質(zhì)窖泥的制作提供一定了的理論支撐，可以作為生產(chǎn)和提高產(chǎn)品質(zhì)量的數(shù)據(jù)參考。