色素辣椒InDel-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

李輝玲 董潔 張國(guó)儒 火順利 葉遠(yuǎn)榮 杜珊珊 張建文

摘要：為建立和優(yōu)化色素辣椒的InDel標(biāo)記PCR反應(yīng)體系，篩選多態(tài)性良好且重復(fù)性高的引物，為InDel分子標(biāo)記在色素辣椒輔助育種、品種純度鑒定及遺傳多樣性分析等提供可靠的技術(shù)支持。采用正交試驗(yàn)、單因素試驗(yàn)方法，對(duì)影響擴(kuò)增體系中的模板DNA用量、引物濃度、2×Taq PCR Mix添加量等參數(shù)進(jìn)行3因素4水平的正交試驗(yàn)比較分析，對(duì)循環(huán)數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化分析。結(jié)果表明，對(duì)InDel-PCR體系擴(kuò)增結(jié)果的影響程度中引物濃度最大，其次是模板DNA用量，而2×Taq PCR Mix添加量的影響不大。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，出于成本和模板DNA用量的考慮，確定最佳InDel-PCR反應(yīng)體系（10 μL）：模板DNA用量為35 ng、引物濃度為0.5 μmol/L、2×Taq PCR Mix添加量為5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃變性60 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃變性5 min;擴(kuò)增產(chǎn)物在4 ℃保存。從240對(duì)InDel通用引物中最終篩選出14對(duì)適用于色素辣椒InDel-PCR候選引物。InDel標(biāo)記是基于PCR的分子技術(shù)，選擇適宜的引物及模板DNA濃度對(duì)擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定的條帶很重要，優(yōu)化后的10 μL InDel-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，成功篩選出14條多態(tài)性較高的InDel引物，為后續(xù)的色素辣椒分子標(biāo)記研究提供了可靠技術(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：色素辣椒;InDel-PCR;反應(yīng)體系;引物篩選;擴(kuò)增產(chǎn)物;參數(shù)優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S641.303?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）18-0072-05

收稿日期：2020-12-30

基金項(xiàng)目：巴州財(cái)政支持基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：202008、202104）。

作者簡(jiǎn)介：李輝玲（1988—），女，甘肅蘭州人，碩士，助理研究員，主要從事特色作物的育種與栽培。E-mail：12354399@qq.com。

通信作者：張建文，碩士，副研究員，主要從事番茄、色素辣椒等作物的育種與栽培。E-mail：1220743143@qq.com。

辣椒（Cicer arietinum L.）為全球第三大作物，年產(chǎn)量約60億kg[1]。近4年，我國(guó)辣椒平均年種植面積占世界辣椒總種植面積的35%，平均年產(chǎn)量占總產(chǎn)量的46%左右[2];辣椒產(chǎn)業(yè)已然躍升為我國(guó)最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)[3-4]。近年來(lái)許多領(lǐng)域限制人工色素的使用，天然色素需求量呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，據(jù)報(bào)道近年來(lái)辣椒紅素的市場(chǎng)銷售額年增長(zhǎng)率一直保持在10%以上[4]。新疆色素辣椒在20世紀(jì)90年代開(kāi)始在南北疆大范圍、規(guī)模化種植，主要有線椒、板椒、牛角椒、羊角椒等品種。與其他辣椒產(chǎn)地相比，新疆具有光照充足且溫差大的自然條件、機(jī)械化種植程度高、設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展快速[5]等現(xiàn)實(shí)優(yōu)點(diǎn)，這些都為色素辣椒的規(guī)?；a(chǎn)提供了有利的先決條件，使其生產(chǎn)出的色素辣椒紅色素含量和產(chǎn)量高、病蟲(chóng)害少而被國(guó)際市場(chǎng)青睞，成為新疆“紅色產(chǎn)業(yè)”重要組成之一[6]。

InDel標(biāo)記（insertion deletion length polymorphism）通過(guò)對(duì)比同一物種不同個(gè)體或近緣種間的DNA序列，根據(jù)同一位點(diǎn)上插入或缺失（insertion-deletion）的核苷酸片段設(shè)計(jì)引物并用PCR檢測(cè)其多態(tài)性[7]。InDel標(biāo)記具有共顯性、特異性、可重復(fù)性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好且操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[8]，在動(dòng)植物群體遺傳分析、輔助育種等研究中得到了廣泛運(yùn)用[9-10]。目前為止，對(duì)InDel標(biāo)記在色素辣椒PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序和引物篩選等方面進(jìn)行綜合性研究的報(bào)道很少。鑒于此，本試驗(yàn)通過(guò)正交及單因素試驗(yàn)，對(duì)反應(yīng)體系中的引物濃度、模板DNA用量、2×Taq PCR Mix添加量、循環(huán)數(shù)、退火溫度（Tm）等進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一套適用于色素辣椒InDel標(biāo)記的最優(yōu)反應(yīng)體系，并從InDel分子標(biāo)記通用引物中篩選有效引物，為色素辣椒品種鑒定、親緣關(guān)系分析等分子標(biāo)記輔助育種提供可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

8份色素辣椒種子均由巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院特色作物室提供，分別為B58、7-UC、MY、A27、FGH、HJZ、E8、B13（編號(hào)為1～8），于2020年10月在人工氣候室播種育苗，每份材料育苗40株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測(cè) 每個(gè)材料隨機(jī)取至少10株幼苗的嫩葉于密封袋中，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取時(shí)用組織研磨儀鋼珠高頻振蕩破碎法進(jìn)行破碎研磨后參照天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒（目錄號(hào)：DP320）的說(shuō)明提取8份色素辣椒的DNA。具體試驗(yàn)步驟：液氮預(yù)冷研磨儀配套的離心管盒、離心管和鋼珠等，稱取0.4 g葉片置于離心管內(nèi)，放置2個(gè)鋼珠后蓋好蓋子，振蕩破碎頻率設(shè)置為1 800次/min，振蕩 2 min，結(jié)束后用磁鐵小心取出鋼珠，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)的提取步驟獲得葉片粉末基因組DNA。在 140 V 恒壓下，用1%瓊脂糖凝膠電泳15 min后，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照。另用基因槍吸取1 μL DNA在核酸測(cè)定儀（NanoDrop-1000）上測(cè)定其質(zhì)量及濃度，獲取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)[11]及新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所測(cè)序結(jié)果，共設(shè)計(jì)240對(duì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 InDel-PCR擴(kuò)增體系正交試驗(yàn) PCR擴(kuò)增在PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad PCR儀）上進(jìn)行。試驗(yàn)采用10 μL體系，引物濃度、DNA模板量和2×Taq PCR Mix按L16（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），以CIDH303為引物，總計(jì)16次試驗(yàn)。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃冰箱保存擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 退火溫度和循環(huán)數(shù)優(yōu)化 由于引物數(shù)量較多且不同引物最適Tm不同，為提高效率且盡可能地考慮每對(duì)引物的Tm，可根據(jù)引物報(bào)告單上的退火溫度初步設(shè)定范圍。以CIDH303為引物，結(jié)合上述檢測(cè)最優(yōu)參數(shù)配比，對(duì)循環(huán)數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化，設(shè)置梯度為25、35、40、45個(gè)循環(huán)。觀察電泳圖，選擇多態(tài)性好且條帶清晰的循環(huán)數(shù)。

1.2.5 電泳檢測(cè) 采用6.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠來(lái)檢測(cè)各個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用北京六一電泳儀廠的DYY-12型電泳儀，在200 V恒定電壓下電泳 80 min，結(jié)束后小心拆膠，用銀染法顯色直至條帶清晰，在醫(yī)用膠片觀察燈下用數(shù)碼相機(jī)拍照。參考尚小紅等的直觀分析法[12]對(duì)16個(gè)正交組合的電泳圖譜中的條帶進(jìn)行打分，打分依據(jù)：1～4分（清晰條帶少，雜帶多，重復(fù)性差，背景模糊），5～8分（清晰條帶多，有雜帶，重復(fù)性好，背景比較干凈），9～12分（清晰條帶多，無(wú)雜帶，重復(fù)性好，背景清晰），13～16分（清晰條帶多，亮度強(qiáng)，無(wú)雜帶，重復(fù)性好，背景清晰）。數(shù)據(jù)錄入Excel 2016，通過(guò)分析16個(gè)組合的均值（k）和極差（R），得出最佳因素配比和各因素影響程度的大小。

1.2.6 引物篩選 以8份辣椒材料為模板、利用優(yōu)化獲得的最佳InDel-PCR反應(yīng)體系和循環(huán)數(shù)，對(duì)文獻(xiàn)[11]中提到的部分240條InDel引物進(jìn)行篩選，篩選出條帶清晰、穩(wěn)定性良好、差異明顯的引物作為色素辣椒InDel-PCR候選引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板的檢測(cè)

如圖1所示，電泳圖譜中條帶整齊清晰、帶型一致、未見(jiàn)拖尾，樣品間濃度較為均勻。核酸檢測(cè)儀測(cè)定結(jié)果表明，所提DNA質(zhì)量測(cè)定值D260 nm/D280 nm為 1.85～2.00，濃度為81～193 ng/μL。

2.2 InDel-PCR擴(kuò)增體系正交試驗(yàn)的優(yōu)化

擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果（圖2）表明，16個(gè)處理組合的PCR均有條帶顯示，然而擴(kuò)增效果存在明顯差異。進(jìn)行遺傳多樣性分析，要求擴(kuò)增條帶數(shù)量豐富、清晰度高。R越大，說(shuō)明該因素對(duì)擴(kuò)增效果影響越大，k越大，說(shuō)明該水平下的擴(kuò)增效果越好。由表2可知，各因素影響程度表現(xiàn)為引物濃度>模板DNA用量>2×Taq PCR Mix添加量，引物濃度為0.50 μmol/L、模板DNA用量為35 ng、2×Taq PCR Mix添加量為5 μL組合效果最好。綜合考慮以第5組合為最佳組合，即10 μL體系：0.50 μmol/L 引物，35 ng模版DNA，5 μL 2×Taq PCR Mix。

2.3 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

由圖3可知，當(dāng)循環(huán)數(shù)為25個(gè)時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果譜帶模糊;當(dāng)循環(huán)數(shù)達(dá)到35、40、45個(gè)時(shí)擴(kuò)增譜帶清晰易辨。綜合考慮擴(kuò)增總時(shí)長(zhǎng)和譜帶質(zhì)量，最佳的循環(huán)數(shù)為35個(gè)。

2.4 引物篩選

以8份色素辣椒的DNA基因?yàn)槟０澹瑥?40對(duì)InDel通用引物中最終篩選出14對(duì)有效引物（圖4，表3）。

3 討論

運(yùn)用InDel分子標(biāo)記技術(shù)分析不同作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性，分析結(jié)果的分辨率、可重復(fù)性和準(zhǔn)確性都有很大程度的提高[13]，從而在根本上解決了育種過(guò)程中時(shí)有發(fā)生的引種混亂、整理資源費(fèi)時(shí)費(fèi)力、育種材料間遺傳背景相似性高、培育新品種艱難等問(wèn)題[14]。采用正交設(shè)計(jì)能夠用最少的試驗(yàn)次數(shù)來(lái)闡明各試驗(yàn)因素在不同水平間的相互作用，揭示各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響程度和規(guī)律，由此得出最適宜的優(yōu)化結(jié)果。

InDel分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、擴(kuò)增條帶簡(jiǎn)單穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但擴(kuò)增結(jié)果也受體系中各個(gè)因素、多水平的綜合影響。引物濃度過(guò)低時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)不完全，條帶數(shù)量少并且不夠清晰，無(wú)法進(jìn)行有效擴(kuò)增;濃度過(guò)高產(chǎn)生錯(cuò)配， 且形成大量引物二聚體導(dǎo)致非特

異性擴(kuò)增產(chǎn)物增加。DNA模板量濃度太低會(huì)造成沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物、或者擴(kuò)增條帶不完全不穩(wěn)定;模板量濃度過(guò)高又會(huì)增加反應(yīng)體系中抑制反應(yīng)的成分，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶[15]。而擴(kuò)增產(chǎn)量的多少很大程度上由循環(huán)次數(shù)決定。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)的減少不足以滿足電泳需要，條帶不清晰;循環(huán)次數(shù)過(guò)多，當(dāng)反應(yīng)物消耗完就會(huì)進(jìn)行非特異性擴(kuò)增。綜合考慮擴(kuò)增時(shí)間和帶型質(zhì)量，應(yīng)選擇較少的循環(huán)次數(shù)[16-17]。

本試驗(yàn)最終確定色素辣椒Indel-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系（10 μL）：模板DNA用量為35 ng、引物濃度為0.5 μmol/L、2×Taq PCR Mix添加量為5.0 μL，其余用 ddH2O補(bǔ)足。最佳擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性30 s，不同引物的退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。以上述最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序?yàn)榛A(chǔ)， 進(jìn)一步在240對(duì)通用引物中篩選出高多態(tài)性、重復(fù)性良好的14對(duì)InDel有效引物，為色素辣椒的品種鑒定、遺傳多樣性等分子輔助研究提供了理論和技術(shù)支持。

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