楊 佳

濟(jì)源市婦幼保健院(河南 濟(jì)源 459000)

頭孢克肟為口服頭孢類抗菌藥物,對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶有高度穩(wěn)定性。該藥物殺菌力較強(qiáng)且抗菌譜廣,具有高療效及組織滲透性、有效濃度持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、用量小、不良反應(yīng)發(fā)生率低等特點(diǎn)[1-2]。體外研究表明[3],高出成人劑量100多倍時(shí)不會(huì)使細(xì)胞染色體突變及損傷。故該藥安全性較高,可用于兒童抗感染治療,且為較好抗感染治療轉(zhuǎn)換藥。由于頭孢克肟制劑內(nèi)有較多講解產(chǎn)物,受到其余輔料感染,其含量測(cè)定不適宜用紫外法[4]。為此,本研究探討了HPLC對(duì)頭孢克肟干混懸劑的含量測(cè)定,報(bào)道如下。

1 儀器與方法

1.1儀器與試藥 儀器:高效液相色譜儀(安捷倫,型號(hào):1100型)、紫外檢測(cè)器(型號(hào):G1314A型)、進(jìn)樣器(77251I型)、電子天平(AE-104N型)。

試藥:頭孢克肟對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):130503-200502)、乙腈、蒸餾水、頭孢克肟干混懸劑(哈爾濱凱程制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字:H20060266,規(guī)格:1g:50mg)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱,設(shè)置150×4.6mm,5μm；流動(dòng)相氫氧化四丁胺-乙腈,25ml的10%氫氧化四丁胺溶液稀釋至1000ml,pH用磷酸調(diào)節(jié)為7.0,乙腈為3∶1；流速為1.2ml/min；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；進(jìn)樣量為20μL。理論板數(shù)不低于3000[5]。

取系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品與供試品溶液、適量陰性樣品溶液分別注入液相色譜儀中,于條件色譜下測(cè)定并記錄色譜圖。

2.2溶液制備 對(duì)照品溶液:精密稱取適量頭孢克肟對(duì)照品,加入磷酸緩沖液制成每毫升含0.2mg頭孢克肟的對(duì)照品溶液。

供試品溶液:取10袋供試品稱定,研細(xì)后稱取4.4mg放置于100ml容量瓶?jī)?nèi),加入60ml磷酸緩沖液,超聲處理30min,放冷至室溫,再加入緩沖液稀釋至刻度,搖勻過濾。

系統(tǒng)適應(yīng)性溶液:精密稱取50mg供試品置于50ml容量瓶?jī)?nèi),向其加入緩沖液進(jìn)行溶解,再加水30ml沸水浴45min,放冷至室溫后,加入流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。

陰性樣品溶液:根據(jù)處方稱量輔料,按照供試品溶液方法配置陰性樣品溶液[6]。

降解溶液:①酸破壞:取50mg供試品放于50ml容量瓶,加5ml甲醇使其溶解,加入1mol/L鹽酸溶液5ml靜置1h,用同濃度的NaOH溶液與之中和,流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。②堿破壞:取50mg供試品置于50ml容量瓶?jī)?nèi),5ml甲醇溶解,加0.1mol/L NaOH溶液3ml靜置10min,倒入同濃度HCl溶液中和,流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。③氧化破壞:取50mg供試品放置在50ml容量瓶?jī)?nèi),5ml甲醇溶解,加5ml的3%過氧化氫溶液靜置1h,流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。④水解破壞:取50mg供試品于50ml容量瓶?jī)?nèi),甲醇溶解,加30ml水,置于沸水浴內(nèi)45min,放冷后用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。⑤加熱破壞:取50mg供試品,于105℃下加熱3h,放冷后倒入50ml容量瓶,甲醇溶解,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。⑥光照破壞:取50mg供試品,于254nm紫外光照射下進(jìn)行24h照射,后置于50ml容量瓶?jī)?nèi),甲醇溶解,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻[7]。

2.3方法學(xué)考察 陰性干擾:按處方比例制備無頭孢克肟空白樣品,按供試品溶液方法制備陰性對(duì)照品溶液,依次進(jìn)樣。色譜圖見圖1。

圖1

線性關(guān)系考察:精密量取0.1182g頭孢克肟對(duì)照品放于100ml容量瓶?jī)?nèi),緩沖液溶解稀釋至刻度,量取0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置于50ml容量瓶?jī)?nèi),加緩沖液稀釋至刻度搖勻,吸取以上溶液20μL分別注入色譜儀中,根據(jù)色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。以頭孢克肟進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算其回歸方程。結(jié)果顯示,頭孢克肟進(jìn)樣量在0.4～2.4μg與峰面積線性關(guān)系較好[8-9]。

精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液在色譜條件下重復(fù)5次進(jìn)樣,記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD=0.04%,說明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8h進(jìn)樣。結(jié)果峰面積RSD=0.65%,提示供試品溶液在8h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一供試品,分別配置5份供試品溶液,進(jìn)樣。結(jié)果含量RSD=0.45%,說明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取0.26g已知含量樣品,精密稱定。精密加入適量對(duì)照品,按供試品溶液方式制備溶液,用流動(dòng)相稀釋至刻度,進(jìn)樣記錄峰面積,測(cè)量含量并計(jì)算回收率[10-11]。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4樣品含量測(cè)定 分別取10份樣品,按供試品溶液方式制備20μL溶液放置色譜儀內(nèi),記錄色譜圖,根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算樣品中頭孢克肟含量,與2015版藥典中頭孢克肟含量測(cè)定方法測(cè)定結(jié)果比較[12]。結(jié)果批號(hào)為091001、091002、091003、091004、091005、091006、091007、091008、091009、091010樣品中含量分別為44.8、44.6、43.9、43.6、44.2、43.8、43.9、44.5、44.4mg/g。

3 討論

頭孢克肟為常用的頭孢類抗菌藥物,對(duì)大部分革蘭陰性、陽性均有較強(qiáng)抗菌性,能抑制多數(shù)菌種,臨床多用于泌尿系統(tǒng)、呼吸道感染等治療,不良反應(yīng)較少?！吨袊?guó)藥典》中關(guān)于頭孢克肟及制劑的含量測(cè)定采用四丁基氫氧化銨溶液作為其流動(dòng)相[13]。由于頭孢克肟分子結(jié)構(gòu)中有弱酸性和弱堿性基團(tuán),故可調(diào)節(jié)溶液pH改變解離狀態(tài),進(jìn)而調(diào)節(jié)在反向色譜上保留時(shí)間。本研究使用固定0.025mol/L磷酸鹽緩沖液濃度,10%乙腈,十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑,流動(dòng)相pH改為3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2,考察系統(tǒng)適用性溶液內(nèi)不同pH流動(dòng)相對(duì)頭孢克肟保留時(shí)間、分離度及前后相鄰峰、雜質(zhì)峰分離度影響[14]。結(jié)果表明pH增加,頭孢克肟分離度、理論塔板數(shù)減小,由于酸性可能過大,C18基團(tuán)易斷裂,故本試驗(yàn)采用磷酸鹽緩沖液pH3.6作為流動(dòng)相,此時(shí)頭孢克肟有合適保留時(shí)間、理論板數(shù),其峰形較理想[15]。固定流動(dòng)相pH3.6,改變乙腈為5%、10%、15%,結(jié)果顯示,乙腈為5%,頭孢克肟峰保留時(shí)間長(zhǎng)；乙腈為15%時(shí),頭孢克肟峰與其E異構(gòu)體峰難以分離；當(dāng)乙腈為10%,頭孢克肟峰及其異構(gòu)體峰保留時(shí)間較適中,分離度也較好,故本實(shí)驗(yàn)選擇10%含量的乙腈。

綜上所述,本研究中色譜柱、流動(dòng)相比例、流速、主峰峰形均良好,分離效果較佳；操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,可用于頭孢克肟干混懸劑含量測(cè)定。