高效液相色譜指紋圖譜聯(lián)合一測多評法評價白虎湯質(zhì)量*

熊鑫，黃傳奇，程璐，張鷹

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

白虎湯是醫(yī)圣張仲景《傷寒論》所載方劑，由知母、石膏、炙甘草、粳米組成，是治療陽明氣分熱盛證的經(jīng)方，具有清熱生津功效。生石膏為白虎湯君藥，具有清陽明氣分之熱功效；知母能解熱除煩?，F(xiàn)代藥理研究表明，白虎湯具有抗炎、解熱等功效。中藥復(fù)方制劑療效由多組分共同作用決定，一般質(zhì)量分析僅能測定其單一成分含量，無法全面分析中藥復(fù)方制劑多種成分質(zhì)量。指紋圖譜分析能體現(xiàn)中藥及其復(fù)方制劑整體性[1-3]，一測多評(quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS)則能通過單一對照品，實現(xiàn)對多個指標(biāo)成分的含量分析[4-6]。筆者采用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜結(jié)合QAMS法對復(fù)雜中藥組成多個成分進(jìn)行含量分析，全面控制其內(nèi)在質(zhì)量[7-9]。上述兩種方法結(jié)合分析中藥制劑質(zhì)量具有成本低、快速、方便的優(yōu)點，能為準(zhǔn)確全面評價中藥質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1260液相色譜儀，Waters e2695-2489高效液相色譜儀，BP211D電子天平(德國賽多利斯公司，Max 210 g，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 新芒果苷對照品(批號：DST161230-017，含量以98.5%計)、芒果苷對照品(批號：DST170516-031，含量以98.5%計)均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；甘草苷對照品(批號：111610-201908，含量以100%計)、甘草酸銨對照品(批號：110731-201116，含量以93.1%計)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純(美國TEDIA公司)，甲酸為分析純(天津市白世化工有限公司)，自制純化水；白虎湯合劑(自制，批號：201108，201112，201115，201117，201119，201201，201205，201207，201210，201215)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 伊利特C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫(0 min，5%A；0～10 min，5%A→15%A；10～25 min，15%A→25%A；25～35 min，25%A→35%A；35～40 min，35%A→70%A；40～41 min，70%A→5%A；41～45 min，5%A)[10-12]；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測波長256 nm；流速1.0 mL·min-1，對照品及供試品在此色譜條件下分離度良好。見圖1。

A.空白溶液；B.白虎湯供試品；C.混合對照品；8.新芒果苷；10.芒果苷；14.甘草苷；18.甘草酸銨。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 分別精密稱取減壓干燥至恒重的新芒果苷對照品(23.49 mg)、芒果苷對照品(10.17 mg)、甘草苷對照品(4.046 mg)和甘草酸銨對照品(5.18 mg)，置不同量瓶，80%甲醇溶解定容，得對照品溶液：新芒果苷469.8 μg·mL-1，芒果苷508.5 μg·mL-1，甘草苷202.3 μg·mL-1，甘草酸銨103.6 μg·mL-1。分別精密量取上述對照品溶液各2 mL，置同一10 mL量瓶，加80%甲醇至刻度，搖勻，得混合對照品溶液(新芒果苷93.96 μg·mL-1，芒果苷101.7 μg·mL-1，甘草苷40.46 μg·mL-1，甘草酸銨20.72 μg·mL-1)。

2.2.2供試品溶液 取批號為201215的白虎湯合劑，精密移取2 mL置20 mL量瓶，加80%甲醇至刻度，搖勻，取續(xù)濾液過孔徑0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 將“2.2.1”項配制的混合對照品溶液按“2.1”項色譜條件，分別自動進(jìn)樣2，4，8，12，16，20 μL，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，表明各成分在進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.2精密度實驗 取“2.2.2”項供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄共有峰保留時間和峰面積，結(jié)果新芒果苷、芒果苷、甘草苷和甘草酸銨峰面積RSD分別為0.58%，0.42%，1.12%和1.02%，以10號峰芒果苷為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積比值均<3%，相似度均>95%，說明儀器精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性實驗 取“2.2.2”項供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別于0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣，記錄共有峰得保留時間和峰面積，結(jié)果新芒果苷、芒果苷、甘草苷和甘草酸銨峰面積RSD分別為1.03%，0.88%，1.43%和0.94%，以10號峰芒果苷為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積均<3%，相似度均>95%，說明供試品室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復(fù)性實驗 取批號201215白虎湯合劑，按“2.2.2”項方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，記錄共有峰保留時間和峰面積，結(jié)果新芒果苷、芒果苷、甘草苷和甘草酸銨峰面積 RSD 分別為0.96%，1.15%，0.83%和0.96%，以10號峰芒果苷為參照峰，測得樣品各共有峰相對保留時間和相對峰面積均<3%，說明該供試品制備方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收率實驗 精密吸取已知含量白虎湯合劑(批號：201215)6份各1 mL，分別置20 mL量瓶，分別加入混合對照品適量，加80%甲醇至刻度，定容，過濾，取續(xù)慮液按“2.1”項色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算各成分加樣回收率。結(jié)果新芒果苷、芒果苷、甘草苷和甘草酸銨平均加樣回收率分別為99.16%，98.73%，98.42%和98.53%，RSD分別為1.25%，1.09%，0.84%和0.75%。

2.4指紋圖譜

2.4.1指紋圖譜共有模式的建立 取白虎湯合劑10批，按“2.2.2”項方法制備樣品，按“2.1”項色譜條件分別測定并記錄共有峰保留時間和峰面積。將10批白虎湯高效液相色譜圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2010年版)軟件，選擇S1色譜圖為參照圖譜，時間寬度0.05，進(jìn)行多點校正，中位數(shù)法，對色譜圖進(jìn)行匹配，建立白虎湯指紋圖譜，并生成對照色譜圖R，選取18個峰形好、保留時間和峰面積穩(wěn)定的峰為白虎湯共有特征峰，并根據(jù)對照品和保留時間比對，確定其中4個峰分別為新芒果苷、芒果苷、甘草苷和甘草酸銨，且其中10號色譜峰芒果苷分離度好，峰面積穩(wěn)定，故選芒果苷為本制劑HPLC指紋圖譜參照峰，見圖2。

2.4.2相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2010年版)軟件對10批白虎湯合劑進(jìn)行指紋圖譜分析，10批白虎湯合劑指紋圖譜相似度均>0.95。以10號峰芒果苷為參照峰，計算共有峰相對保留時間和相對峰面積，見表2。

表2 10批白虎湯合劑HPLC 指紋圖譜共有峰相對保留時間及相對峰面積

8.新芒果苷；10.芒果苷；14.甘草苷；18.甘草酸銨。

2.5QAMS

2.5.1相對校正因子計算[13-15]QAMS相對校正因子的計算公式為fm/s=(CS×Am)/(Cm×AS)，其中CS/AS分別為內(nèi)參物的質(zhì)量濃度和峰面積，Am/Cm分別為待測成分的峰面積和質(zhì)量濃度。樣品中待測成分質(zhì)量濃度的計算公式為：Cm=(CS’×Am)/(fm/S×AS’)，其中CS’為外標(biāo)法測得的待測樣品中內(nèi)參物質(zhì)量濃度，Am為樣品中待測成分的峰面積，AS’為內(nèi)參物峰面積。

取“2.2.1”項混合對照品溶液，使用伊利特C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱按“2.1”項色譜條件在安捷倫1260液相色譜儀上進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨分別與芒果苷的平均f，結(jié)果見表3。

表3 待測成分相對校正因子

2.5.2f重現(xiàn)性考察 采用4根不同色譜柱(伊利特C18，Thermo ODS-BPC18，InertSustain?C18，UItimate-C18)分別考察兩臺不同高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫1260高效液相色譜儀，Waters e2695-2489高效液相色譜儀)；采用伊利特C18色譜柱和安捷倫1260高效液相色譜儀考察不同進(jìn)樣量(4，8，12，16，20 μL)、不同柱溫(28，30和32 ℃)、不同流量(0.8，1.0，1.2 mL·min-1)對f影響，見表4。結(jié)果顯示，f重現(xiàn)性良好(RSD<2%)。

表4 各因素對相對校正因子(f)的影響

2.5.3待測組分色譜峰的定位 準(zhǔn)確定位待測成分才能保證QAMS法的正確使用，一般采取相對保留時間并結(jié)合色譜峰整體特征來對待測組分定位，本實驗考察了各待測組分在不同色譜柱中相對保留時間的重復(fù)性，結(jié)果顯示，各成分相對保留時間RSD均<2，重復(fù)性良好，結(jié)果見表5。

表5 各成分色譜峰定位

2.5.4QAMS與外標(biāo)法測定結(jié)果比較 取白虎湯合劑3批，分別按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，分別采用外標(biāo)法和QAMS進(jìn)行含量計算，比較兩種方法結(jié)果，見表6，RSD均<2，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明所建立的方法適用于白虎湯合劑，可用于白虎湯合劑質(zhì)量控制。

表6 QAMS與外標(biāo)法測定結(jié)果比較

3 討論

3.1波長選擇 白虎湯由石膏、知母、甘草和粳米組成，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020年版，知母中芒果苷測定波長為258 nm，甘草苷和甘草酸銨測定波長為237 nm，參考文獻(xiàn)及對樣品進(jìn)行全波長掃描，對圖譜進(jìn)行分析，最后確定本實驗中對照品及樣品測定波長為256 nm，在此波長處，樣品色譜峰豐富，特征峰分離度良好，靈敏度高，干擾少，新芒果苷與芒果苷吸收度強，甘草苷與甘草酸銨指認(rèn)明顯，能完整展示白虎湯HPLC圖譜，故選擇256 nm作為白虎湯指紋圖譜測定波長。

3.2流動相選擇 本實驗選擇甲醇-磷酸水、甲醇-甲酸水、乙腈-磷酸水和乙腈-甲酸水等多個濃度系統(tǒng)對白虎湯合劑供試品進(jìn)行流動相選擇，在摸索流動相條件過程中，峰型與分離度是首要考慮因素，在乙腈-0.1%甲酸水梯度下，樣品色譜峰峰型好，無前沿或拖尾，分離度好，能較好表達(dá)白虎湯合劑指紋圖譜，故選擇作為白虎湯合劑流動相。

3.3特征峰選擇 在256 nm波長處，白虎湯合劑HPLC圖譜共有峰較多，且新芒果苷、芒果苷、甘草苷和甘草酸銨均能被指認(rèn)，其中芒果苷保留時間穩(wěn)定，特征性強，故選擇其作為參照峰。本實驗中，白虎湯合劑標(biāo)出特征峰18個，結(jié)合參照峰計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果均好。

將指紋圖譜與QAMS相結(jié)合的實驗技術(shù)，能在缺少部分對照品的情況下準(zhǔn)確定量其他成分。本實驗中，10批白虎湯指紋圖譜相似度均>0.95，各類計算結(jié)果RSD值均在合理范圍內(nèi)，表明白虎湯合劑各批次間無差別且建立的方法簡單易操作，能夠用于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗。