曹汝菲 李澤軒 許歡 張莎 張敏敏 戴楓 段曉雷，3

（1. 遵義醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，遵義 563000；2. 遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遵義 563000；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌712100）

脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）是人類(lèi)和動(dòng)物腸道內(nèi)厭氧菌群中的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)于維護(hù)宿主正常生理機(jī)能至關(guān)重要［1］。當(dāng)下消化道的某一部位受損或預(yù)先有病理改變時(shí)，脆弱擬桿菌會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)會(huì)致病菌［2］。脆弱擬桿菌在轉(zhuǎn)化為機(jī)會(huì)致病菌時(shí)，多項(xiàng)解旋酶基因的表達(dá)量會(huì)發(fā)生改變，表明相關(guān)解旋酶很可能參與了機(jī)會(huì)致病過(guò)程的應(yīng)激變化［3-4］。此外，不同于其他種的擬桿菌，脆弱擬桿菌機(jī)會(huì)致病菌的全基因組中G+C含量明顯偏高，而且特異GC結(jié)構(gòu)相對(duì)豐富而穩(wěn)定［4］，這一特征恰恰符合在氧化應(yīng)激條件下G4 DNA結(jié)構(gòu)易在調(diào)控區(qū)域形成的特點(diǎn)。這些DNA水平的異常變化，提示出特異調(diào)控G4 DNA異常形成的解旋酶很可能在脆弱擬桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)會(huì)致病菌過(guò)程中扮演重要角色。最新的研究表明，脆弱擬桿菌轉(zhuǎn)變成為機(jī)會(huì)致病菌的多種解旋酶（包括Pif1解旋酶）在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平都發(fā)生了表達(dá)差異［5-6］，這些變化表明B.f Pif1解旋酶很可能在其機(jī)會(huì)致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

B.f Pif1解旋酶屬于Pif1解旋酶家族成員；該蛋白家族是一類(lèi)特異性解旋G4 DNA以及G-rich序列的高度保守的DNA解旋酶，其對(duì)于細(xì)胞內(nèi)基因組穩(wěn)定性的維持至關(guān)重要［7-8］；前人的研究已明確證實(shí)脆弱擬桿菌屬中存在此類(lèi)解旋酶（B.f Pif1）［9］。近年來(lái)的大量研究表明，不同物種的解旋酶具有特異的生物學(xué)活性。例如，小鼠mPif1解旋酶失活可引起相關(guān)線(xiàn)粒體肌?。?0］、釀酒酵母Sc.Pif1解旋dsDNA活性由于結(jié)合G4 DNA而顯著增強(qiáng)［11］、白色念球菌Ca.Pif1解旋酶具有特異性3'-5'核酸外切酶活性等［12］，而這些功能差異性往往是由于其結(jié)構(gòu)差異性造成的。因此，科學(xué)界也開(kāi)始積極關(guān)注許多物種Pif1解旋酶結(jié)構(gòu)的研究：Bs.Pif1與ssDNA復(fù)合物晶體成為首個(gè)Pif1蛋白成員的蛋白結(jié)構(gòu)被解析［13］，研究最廣泛的Sc.Pif1解旋酶的共結(jié)晶報(bào)道為其分子機(jī)制的研究開(kāi)啟新篇章［14］，而人類(lèi)hPif1解旋酶更是“十年磨一劍”終于在2019年得以發(fā)表其晶體結(jié)構(gòu)信息［15］。但是，迄今為止，有關(guān)B.f Pif1解旋酶的蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究仍處于空白階段。

本研究通過(guò)對(duì)B.f Pif1解旋酶進(jìn)行原核表達(dá)與純化，獲得高純度、高濃度的B.f Pif1蛋白；再利用多種結(jié)晶試劑盒進(jìn)行結(jié)晶篩選及晶體生長(zhǎng)條件優(yōu)化，并進(jìn)行該蛋白晶體的初步X射線(xiàn)衍射，為下一步的晶體衍射優(yōu)化、B.f Pif1蛋白結(jié)構(gòu)解析及功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、引物與質(zhì)粒 Bacteroides fragilis菌株購(gòu)自于ATCC；前期同源序列比對(duì)與預(yù)試驗(yàn)中可溶性分析等明確B.f Pif1解旋酶的全長(zhǎng)序列（NCBI Sequence ID：WP_005787496.1，833Aa）中 的21-402 aa為解旋酶核心結(jié)構(gòu)域，可進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)研究，目的基因B.f Pif1核心結(jié)構(gòu)域上游引物：5'-GGAATT CCATATGCTTTTTCTGACAGGAAAGGCC-3'，下游引物：5'-CCGCTCGAGCTTACAACGACTCAGAGCGAC AT-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。大腸桿菌DH5α菌株、表達(dá)載體pET15b-SUMO，以及E.coli BL21（DE3）菌株均購(gòu)自大連寶生物公司。

1.1.2 試劑 SUMO蛋白酶由遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院段曉雷課題組自行制備。RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。高保 真DNA聚 合 酶PrimerSTAR、T4 DNA連 接 酶、Nde I、BamH I、Xho I等限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自大連寶生工生物工程有限公司。鎳-親和層析柱（Ni-NTA）、Superdex 200（S200）凝膠過(guò)濾層析柱、DEAE陰離子交換柱、PD MiniTrap G-25預(yù)裝脫鹽柱以及超濾離心管均購(gòu)自美國(guó)GE公司。質(zhì)粒抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自康為公司。Salt RxTMI、IndexTM、Cystal screen I和Cystal screen II、PEG I和PEG II結(jié)晶篩選試劑盒購(gòu)自美國(guó)Hampton Research公司。

1.2 方法

1.2.1 B.f Pif1解旋酶的原核表達(dá)載體構(gòu)建 提取脆弱擬桿菌總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，使用靶標(biāo)基因特異性引物，參照PrimerSTAR標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 10 s，58.5℃ 15 s，72℃ 1 min 15 s（34 cycles）。PCR產(chǎn)物經(jīng)Nde I/EcoRI雙酶切，由T4酶連接后構(gòu)成pET15b-SUMO-B.f Pif1重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入DH5α，涂布于LB/Amp（100 μg/mL）平板，篩選陽(yáng)性克隆菌株，挑取陽(yáng)性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，再進(jìn)行雙酶切鑒定；同時(shí)將重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 B.f Pif1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定成功的pET15b-SUMO-B.f Pif1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/Amp（50 μg/mL）平板，挑取單克隆菌株再接種至5 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化；按1∶1 000比例轉(zhuǎn)接至3 L液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，以37℃ 200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600為0.5左右，按1∶1 000比例加入不同濃度的IPTG（0.1、0.3、0.5與0.8 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)，并在不同誘導(dǎo)溫度（37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h、28℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h、18℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h）下誘導(dǎo)目的蛋白（B.f Pif1）的表達(dá)。

1.2.4 SUMO酶切與第二次Ni-NTA親和層析 將第一次Ni-NTA純化產(chǎn)物進(jìn)行SUMO蛋白酶酶切，按SUMO酶與待純化蛋白1∶100的質(zhì)量比加入，4℃透析過(guò)夜。次日，將酶切與透析后的蛋白溶液再次流經(jīng)鎳柱純化，并用鎳柱洗脫液洗脫帶His-Tag的雜蛋白和SUMO酶，并收集Ni-NTA流出液及平衡液進(jìn)行10% SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.5 DEAE陰離子交換柱層析 將上一步純化產(chǎn)物（蛋白溶液）快速（15 mL/min）流經(jīng)脫鹽預(yù)裝柱，以置換buffer為離子交換柱平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.2、100 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA和10%甘油）。將脫鹽后蛋白溶液上樣至預(yù)平衡的DEAE陰離子交換柱內(nèi)，以1.5 mL/min流速、按NaCl濃度線(xiàn)性梯度（l00-1 000 mmol/L）進(jìn)行蛋白洗脫——利用AKTA prime plus色譜系統(tǒng)監(jiān)測(cè)離子交換層析中的蛋白吸收峰變化，分部收集洗脫峰對(duì)應(yīng)的蛋白溶液，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.6 Supdex 200凝膠過(guò)濾層析（分子篩） 預(yù)先用分子篩平衡緩沖液（20 mmol/L Tris pH 7.5、300 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT和1 mmol/L EDTA）平衡S200分子篩，隨后依據(jù)分子量大小分離純化蛋白：將蛋白樣品濃縮到1 mL上樣，用一個(gè)柱體積（約130 mL）的分子篩平衡緩沖液洗脫（流速為0.5 mL/min，壓強(qiáng)上限0.4 MPa），并結(jié)合紫外吸收峰收集目的蛋白。最后用SDS-PAGE相關(guān)的灰度分析法檢測(cè)蛋白純度，并用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.7 驗(yàn)證純化蛋白的活性 B.f Pif1重組蛋白的最終純化產(chǎn)物需超濾濃縮后，加入20%終濃度甘油，液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆?。利用Stopped-flow設(shè)備對(duì)純化好的B.f Pif1蛋白進(jìn)行解旋酶活性與解旋極性檢測(cè)［16-17］，以驗(yàn)證B.f Pif1解旋酶活性。

1.2.8 B.f Pif1蛋白結(jié)晶初篩與晶體生長(zhǎng)條件優(yōu)化

采用Salt RxTMI、IndexTM、Cystal screen I和Cystal screen II、PEG I和PEG II等多種結(jié)晶初篩試劑盒對(duì)低溫高速離心后的B.f Pif1蛋白進(jìn)行晶體初步篩選；初篩條件是：晶體生長(zhǎng)池中含1 μL上述結(jié)晶篩選試劑盒中的成分液與1 μL B.f Pif1蛋白，平衡池則為98 μL試劑，結(jié)晶機(jī)器人反應(yīng)室內(nèi)溫度設(shè)定為4℃和20℃。該機(jī)器人主要利用棋盤(pán)法原理進(jìn)行條件優(yōu)化，主要包括蛋白質(zhì)濃度、pH緩沖液、沉淀劑/添加劑種類(lèi)、濃度及組合等。

1.2.9 B.f Pif1蛋白晶體的初步X射線(xiàn)衍射 對(duì)初篩優(yōu)化后狀態(tài)良好若干B.f Pif1蛋白晶體進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)：此時(shí)晶體生長(zhǎng)采用座滴氣相擴(kuò)散法；再將逐步分散培養(yǎng)的晶體置于16℃晶體培養(yǎng)箱，每天于顯微鏡下觀察記錄晶體生長(zhǎng)狀況。待培養(yǎng)2周左右，挑取靶標(biāo)蛋白晶體，放置于MAR 345DTB X-ray衍射儀的衍射套環(huán)上，進(jìn)行X射線(xiàn)衍射并收集衍射數(shù)據(jù)，并將衍射后的蛋白晶體經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)再次明確其為B.f Pif1蛋白。初步X-ray衍射數(shù)據(jù)較好的蛋白晶體采用液氮保存，后續(xù)送上海光源同步輻射進(jìn)一步研究。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)表達(dá)載體pET15b-SUMO-B.f Pif1示意圖（圖1-A）進(jìn)行載體構(gòu)建，并通過(guò)菌落PCR與重組質(zhì)粒EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果（圖1-B）顯示，PCR與酶切產(chǎn)物大小均約為1 200 bp，與靶標(biāo)基因序列（1 146 bp+酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基）預(yù)期相符。此外，重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與B.f Pif1解旋酶的靶標(biāo)序列完全一致，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

“風(fēng)雨說(shuō)”以黃進(jìn)為首提出的，他們認(rèn)為廣東丹霞地貌及北國(guó)山山頂?shù)纳习伎有纬芍饕怯娠L(fēng)化、雨水的滴蝕、溶蝕作用下產(chǎn)生的，稱(chēng)之為“風(fēng)化、雨滴溶蝕說(shuō)”，簡(jiǎn)稱(chēng)“風(fēng)雨說(shuō)”。

圖1 表達(dá)載體pET15b-SUMO-B.f Pif1的構(gòu)建Fig. 1 Construction of expression vector pET15b-SUMOB.f Pif1

2.2 B.f Pif1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件（主要是不同IPTG濃度與不同誘導(dǎo)溫度）的優(yōu)化（圖2），該重組蛋白的最佳IPTG工作濃度為0.5 mmol/L，最適誘導(dǎo)溫度為18℃（180 r/min）誘導(dǎo)16 h。超聲破碎后，SDS-PAGE檢測(cè)分離蛋白的上清液與沉淀，結(jié)果顯示（圖2，圖3-A），均有一條大小約為70 kD的誘導(dǎo)蛋白，并與期望結(jié)果大小相符（B.f Pif1蛋白+His-Tag+SUMO His-Tag），該目的蛋白可溶性良好。再與Ni-NTA親和層析柱結(jié)合后，穿出液明顯下降（圖3-A），說(shuō)明目標(biāo)蛋白結(jié)合鎳柱效果優(yōu)良。

圖2 不同IPTG濃度與不同誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)B.f Pif1蛋白的表達(dá)Fig. 2 Expression of B.f Pif1 protein induced with different IPTG concentrations and different induction temperatures

2.3 鎳柱純化與SUMO酶切

待蛋白上清液流經(jīng)鎳柱后，用含有不同咪唑濃度的洗脫液將融合蛋白從鎳柱上洗脫，接收各個(gè)洗脫液組分，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖3-B）顯示，在300 mmol/L咪唑濃度條件下，重組蛋白被大量洗脫下來(lái)（盡管含有部分雜蛋白條帶）。SUMO酶切前后的電泳結(jié)果（圖3-C）顯示，融合蛋白解體、目的蛋白與SUMO-Tag等蛋白標(biāo)簽分離。再經(jīng)第二次鎳柱純化，SDS-PAGE檢測(cè)純化結(jié)果（圖3-D）說(shuō)明SUMO及His標(biāo)簽已被留在鎳柱上；而無(wú)標(biāo)簽的目的蛋白在Ni-NTA穿出液內(nèi)，條帶約為45 kD，與理論值相符。

圖3 B.f Pif1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鎳柱純化與SUMO酶切Fig. 3 Induced expression，Ni-NTA purification and SUMO digestion of B.f Pif1 protein

2.4 經(jīng)DEAE陰離子交換柱層析的純化

使用DEAE陰離子交換柱對(duì)經(jīng)第二次鎳柱洗脫后的蛋白溶液進(jìn)一步純化，利用AKTA自帶程序監(jiān)測(cè)層析過(guò)程中蛋白紫外吸收?qǐng)D譜，準(zhǔn)確收集洗脫液（圖4-A），結(jié)果表明，隨著NaCl濃度的梯度增加，B.f Pif1蛋白經(jīng)過(guò)DEAE陰離子交換柱出現(xiàn)了2個(gè)特異蛋白吸收峰；對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE結(jié)果則顯示吸收峰A內(nèi)的目的蛋白更純，而且濃度較大，經(jīng)過(guò)本步驟純化，蛋白純度得到進(jìn)一步提高至85%，但仍有少量雜蛋白存在。

圖4 B.f Pif1蛋白的DEAE離子交換層析與S200分子篩純化Fig. 4 Purifications of B.f Pif1 protein by DEAE ion-exchange chromatography and S200 gel filtration chromatography

2.5 B.f Pif1重組蛋白的凝膠過(guò)濾層析

利用蛋白質(zhì)分子量的差異，將上一步純化后的蛋白溶液通過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱superdex200（GE Healthcare）作進(jìn)一步純化，并去除蛋白多聚體（以利于蛋白結(jié)晶的出現(xiàn)）。結(jié)果顯示（圖4-B），若在過(guò)分子篩之前加入3 mmol/L DTT處理2 h，再經(jīng)過(guò)S200凝膠過(guò)濾層析純化，B.f Pif1單體狀態(tài)成為其主要成分，而二聚體含量極低，表明純化過(guò)程中可能產(chǎn)生的B.f Pif1二聚體等被DTT還原其二硫鍵所抑制。最終純化產(chǎn)物經(jīng)10%SDS-PAGE檢測(cè)與灰度分析，目的蛋白純度達(dá)98.5%（圖4-C）；蛋白超濾濃縮后，經(jīng)BCA法測(cè)得濃度為17 mg/mL，達(dá)到預(yù)期要求，有利于后續(xù)晶體的生成。

2.6 B.f Pif1蛋白的生物學(xué)活性驗(yàn)證

若想了解B.f Pif1解旋酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，必須保證表達(dá)純化后的目的蛋白具有良好的生物學(xué)活性，即揭示其蛋白結(jié)構(gòu)必須為其天然構(gòu)象。利用Stopped-flow FRET檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證純化所得B.f Pif1蛋白是具有活性的解旋酶（圖5-A），純化后的B.f Pif1蛋白可利用ATP解旋dsDNA與含G4 DNA的底物（熒光信號(hào)顯著增加）；而且還發(fā)現(xiàn)B.f Pif1解旋含G4 DNA的活性明顯優(yōu)于解旋dsDNA。此外，還驗(yàn)證了B.f Pif1蛋白的解旋極性（圖5-B），B.f Pif1解旋5'-ssDNA-G4-dsDNA時(shí)熒光信號(hào)增加，而與3'-ssDNA-G4-dsDNA反應(yīng)則幾乎無(wú)熒光信號(hào)變化，表明該蛋白具有Pif1家族解旋酶特異的5'-3'解旋方向性。

圖5 純化后B.f Pif1蛋白具有良好的生物學(xué)活性Fig. 5 Purified B.f Pif1 protein showing good biological activity

2.7 B.f Pif1蛋白結(jié)晶初篩與結(jié)晶條件優(yōu)化

利用多種蛋白結(jié)晶試劑盒對(duì)B.f Pif1蛋白晶體進(jìn)行初篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多個(gè)條件下出現(xiàn)微晶；繼續(xù)培養(yǎng)后這些晶體逐漸生長(zhǎng)（圖6-A和6-B），1周后其寬度為12-20 μm，長(zhǎng)度為110-190 μm，呈細(xì)長(zhǎng)棒狀的孿晶形態(tài)；同時(shí)使用蛋白結(jié)晶專(zhuān)用檢測(cè)的UY200型顯微鏡鑒定（圖6-C），明確這些結(jié)晶為蛋白質(zhì)晶體，只有蛋白晶體才會(huì)在280 nm紫外光下特異顯示（圖6-C為圖6-B在紫外顯微鏡下的成像）。隨后在已篩選培養(yǎng)出蛋白晶體的基礎(chǔ)上，大量?jī)?yōu)化晶體培養(yǎng)條件后（尤其是改變沉淀劑濃度與稀釋蛋白濃度），蛋白孿晶聚集現(xiàn)象逐漸減少（圖7-A）；又更換蛋白結(jié)晶點(diǎn)樣方式為座滴氣相擴(kuò)散法，在蛋白結(jié)晶微滴的邊緣處出現(xiàn)了單個(gè)的蛋白晶體，不同條件下呈現(xiàn)規(guī)則的長(zhǎng)方體或立方體晶體（圖7-B）。

圖6 結(jié)晶試劑盒初篩得到B.f Pif1晶體Fig. 6 Protein crystals of B.f Pif1 preliminarily screened with different crystallization kits

圖7 B.f Pif1蛋白晶體培養(yǎng)條件的優(yōu)化Fig. 7 Optimization of the culture conditions for B.f Pif1 protein crystals

2.8 B.f Pif1蛋白晶體生長(zhǎng)變化與X射線(xiàn)衍射初步結(jié)果

在多種蛋白結(jié)晶條件優(yōu)化后，逐步確定了最 佳 結(jié) 晶 條 件：9 mg/mL B.f Pif1、100 mmol/L NH4Acetate、16% PEG4000 pH 6.5以 及0.1 mol/L Bis-Tris乙酸（pH 8.3）、0.05 mol/L碳酸氫鈉、5%甘油和0.015 mol/L亞精胺或0.002 mol/L PEG2000等。不同條件長(zhǎng)出的晶體形態(tài)有所差異，但都為形態(tài)良好的單晶；并且較長(zhǎng)時(shí)間觀察這些條件下晶體生長(zhǎng)與形態(tài)變化（圖8），其中蛋白晶體最長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)間是19 d，此后蛋白晶體不再長(zhǎng)大，形態(tài)規(guī)則的長(zhǎng)方形晶體；但13 d之后，中心區(qū)域晶體出現(xiàn)孿晶現(xiàn)象——因此，后續(xù)挑去邊緣的單晶獨(dú)立培養(yǎng)。經(jīng)多個(gè)最佳晶體生長(zhǎng)條件下獨(dú)立培養(yǎng)的蛋白晶體使用德國(guó)布魯克AXS公司CCD單晶X衍射儀進(jìn)行衍射試驗(yàn)（圖9-A、圖9-B-a和圖9-B-b）；其中，最好的衍射分辨率達(dá)到3.5 ?（圖9-B-c）。隨后對(duì)衍射良好蛋白晶體溶解后再進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該蛋白晶體分子量為45 kD左右，證明這些具有良好衍射特征的蛋白晶體就是B.f Pif1解旋酶蛋白。

圖8 B.f Pif1蛋白晶體生長(zhǎng)情況Fig. 8 Growths of B.f Pif1 protein crystals

圖9 不同條件下B.f Pif1蛋白單晶的X射線(xiàn)衍射圖譜及其對(duì)應(yīng)蛋白電泳Fig. 9 X-ray diffraction patterns of B.f pif1 protein single crystal under different conditions and its corresponding SDS-PAGE

3 討論

近年來(lái)，在脆弱擬桿菌機(jī)會(huì)致病性研究中其分子機(jī)制成為熱點(diǎn)［18-19］，但此類(lèi)研究往往關(guān)注脆弱擬桿菌病變中某種信號(hào)通路改變而激活個(gè)別轉(zhuǎn)錄因子所產(chǎn)生的致病效應(yīng)，并未深入探討其致病時(shí)應(yīng)激變化可導(dǎo)致相關(guān)差異基因轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的原因。但迄今為止，可高效特異解旋G4 DNA從而維持基因組穩(wěn)定性的脆弱擬桿菌Pif1解旋酶（B.f Pif1）的結(jié)構(gòu)與功能的研究都未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究針對(duì)B.f Pif1表達(dá)純化與結(jié)晶的研究是首次較為深入地探討該方向的相關(guān)研究。

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的深入研究，需要首先獲得高純度（純度＞97%）與高濃度（一般高于10 mg/mL）的B.f Pif1蛋白［20］。在優(yōu)化目的蛋白最佳誘導(dǎo)條件表達(dá)后，本研究設(shè)計(jì)了一系列的蛋白純化方案，其中SUMO酶切結(jié)合Ni-NTA親和層析最為關(guān)鍵。借鑒Marblestone等［21］關(guān)于SUMO表達(dá)體系應(yīng)用的報(bào)道，本研究選用SUMO工具酶以利用其以下優(yōu)勢(shì)：（1）該融合標(biāo)簽不僅促進(jìn)蛋白的可溶性，而且還具有分子伴侶功能，能幫助目的蛋白構(gòu)象的正確折疊［22］；（2）其分子量較小，相比于TEV 蛋白酶更加高效，這一點(diǎn)是在之前類(lèi)似研究基礎(chǔ)上的優(yōu)化與改進(jìn)；（3）使用本實(shí)驗(yàn)室自行純化并在前期研究中已經(jīng)驗(yàn)證活性的SUMO蛋白酶［23］，在簡(jiǎn)化純化需求的同時(shí)，成功將蛋白純度從85%提升至95%；（4）采用SUMO表達(dá)體系，經(jīng)過(guò)第二次鎳柱純化后，能夠最大限度去除原有的SUMO-Tag及N端的His-Tag標(biāo)簽，不含任何標(biāo)簽的蛋白質(zhì)本身更容易結(jié)晶，并且所結(jié)晶體更接近天然構(gòu)象狀態(tài)［24］。經(jīng)過(guò)第一步親和層析后，利用B.f Pif1蛋白pI＜7的生化特征，選擇DEAE弱陰離子交換層析進(jìn)行蛋白的分離純化；但結(jié)果中仍有少量的雜蛋白。再借鑒清華大學(xué)李海濤課題組相關(guān)研究中的純化思路［25］，選取Superdex 200凝膠過(guò)濾層析純化，為有利于蛋白單晶的形成，選用3 mmol/L DTT破壞二硫鍵以?xún)?yōu)化蛋白聚集狀態(tài)，這與此前BsPif1晶體結(jié)構(gòu)研究中結(jié)晶前處理相一致［13］。

本研究要進(jìn)行蛋白結(jié)晶與晶體結(jié)構(gòu)分析，還需驗(yàn)證表達(dá)純化產(chǎn)物是具有活性驗(yàn)證，結(jié)果顯示純化后的B.f Pif1蛋白具有良好的解旋活性，并且解旋含G4 DNA底物的活性更強(qiáng)，這一點(diǎn)跟前人報(bào)道多種Pif1解旋酶的特征相符［11，26］；同時(shí)還驗(yàn)證出該解旋酶具有Pif1解旋酶家族特異5'-3'解旋極性，揭示本研究獲得B.f Pif1解旋酶蛋白具有其天然構(gòu)象，適于后續(xù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究。

不同蛋白的結(jié)晶條件千差萬(wàn)別，往往與結(jié)晶方法及所需結(jié)晶蛋白的純度、特性、緩沖液等因素相關(guān)［27］。本研究中B.f Pif1蛋白結(jié)晶進(jìn)行了大量的篩選，有至少6個(gè)初始晶體條件可以篩選出晶型較好、生長(zhǎng)穩(wěn)定重復(fù)性好的B.f Pif1蛋白晶體（紫外顯微鏡與蛋白電泳均證實(shí)）；在此基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)晶體，調(diào)整沉淀劑濃度與稀釋蛋白質(zhì)濃度以及采用16℃的座滴法，此類(lèi)優(yōu)化方法與前人研究類(lèi)似［14］；最終所獲蛋白單晶使用X-ray初步衍射其衍射點(diǎn)最高分辨率達(dá)到3.5 ?，提示本研究條件下的最佳B.fPif1蛋白單晶生長(zhǎng)條件為0.1 mol/L Bis-Tris乙酸（pH 8.3）、0.05 mol/L碳酸氫鈉、5%甘油和0.015 mol/L亞精胺。對(duì)比分析本研究與其他Pif1解旋酶家族成員的結(jié)晶條件［13，15］：不同Pif1解旋酶家族成員（無(wú)論是單蛋白晶體還是蛋白復(fù)合物共結(jié)晶）的結(jié)晶條件都各不相同；即使同一Pif1蛋白的高分辨率結(jié)晶條件也可以存在多個(gè)。待后續(xù)B.f Pif1晶體送上海光源高能衍射后為獲得更高分辨率，結(jié)晶條件可能被進(jìn)一步優(yōu)化；隨后的硒代培養(yǎng)蛋白的結(jié)晶或B.f Pif1與G-rich的ssDNA共結(jié)晶晶體的優(yōu)化條件也必然需要進(jìn)一步探討。

盡管西北農(nóng)林科技大學(xué)奚緒光課題組前期曾成功對(duì)Bs.Pif1解旋酶蛋白進(jìn)行晶體研究［26］，表明該蛋白是Pif1解旋酶家族中首次被成功結(jié)晶與解析的蛋白質(zhì)；但是本研究所結(jié)晶的B.f Pif1與BsPif1在序列與功能上存在一些明顯的差異性。首先，同源序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明兩者間所具有序列保守性，但也存在氨基酸一級(jí)序列明顯差異位點(diǎn)與區(qū)段（數(shù)據(jù)未給出），這主要源于2種細(xì)菌不同生長(zhǎng)環(huán)境所需維持不同基因組穩(wěn)定性的Pif1解旋酶進(jìn)化過(guò)程中的差異性［4，23］。其次，功能上差異則主要根據(jù)其生理生化特征不同：BsPif1是普通擬桿菌內(nèi)的一種Pif1解旋酶，其臨床意義不大；而本研究探索的B.f Pif1則是與人類(lèi)腸道菌群中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的脆弱擬桿菌［28］以及其變?yōu)闄C(jī)會(huì)致病菌［2］的過(guò)程中所形成G-rich序列特異調(diào)控相關(guān)的Pif1解旋酶，曾有報(bào)道指出機(jī)會(huì)致病的脆弱擬桿菌基因組內(nèi)存在G+C含量異常升高與特異基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA結(jié)構(gòu)異常變化［4-5］，提示在機(jī)會(huì)致病過(guò)程中必然存在高效解旋G-rich序列的解旋酶以維持基因組穩(wěn)定性。因此，深入研究B.f Pif1解旋酶的結(jié)構(gòu)與功能將為消化道疾病病變患者體內(nèi)脆弱擬桿菌機(jī)會(huì)致病過(guò)程提供新的研究與診療視角，這正是研究本蛋白結(jié)晶的意義所在。

在本研究成功表達(dá)純化B.f Pif1重組蛋白、經(jīng)過(guò)多種結(jié)晶初篩與條件優(yōu)化及初步衍射而獲得了質(zhì)量較好蛋白單晶的基礎(chǔ)上，后續(xù)研究主要將衍射較好的晶體送上海光源進(jìn)行高能量X-ray衍射，硒代培養(yǎng)基發(fā)酵B.f Pif1的純化與結(jié)晶、衍射，以獲得足夠的衍射數(shù)據(jù)與相位信息進(jìn)行B.f Pif1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)解析；同時(shí)還將研究B.f Pif1與特異GC序列DNA共結(jié)晶體的結(jié)構(gòu)，為分析B.f Pif1解旋酶的關(guān)鍵氨基酸作用位點(diǎn)及潛在的治療藥物靶向結(jié)合等奠定前期基礎(chǔ)，為脆弱擬桿菌機(jī)會(huì)致病病變提供新的診斷分子靶點(diǎn)和精準(zhǔn)治療路徑。

4 結(jié)論

成功將B.f Pif1解旋酶進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)與一系列層析純化，獲得具有純度高（＞98.5%）、濃度大（17 mg/mL）、活性強(qiáng)的B.f Pif1蛋白；并利用結(jié)晶機(jī)器人及棋盤(pán)法對(duì)結(jié)晶條件進(jìn)行篩選與優(yōu)化，明確9 mg/mL B.fPif蛋白可在最優(yōu)的結(jié)晶條件為0.1 mol/L Bis-Tris乙酸（pH 8.3）、0.05 mol/L碳酸氫鈉、5%甘油和0.015 mol/L亞精胺下生長(zhǎng)出較好質(zhì)量的晶體，其初步X-ray衍射的分辨率可達(dá)3.5 ?。