李 洋，申復(fù)進(jìn)，洪莎莎，李 維，洪 莉

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦科，武漢 430000)

壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)為腹壓比最大尿道壓力大，且不無(wú)膀胱逼尿肌收縮的狀態(tài)下，不自覺(jué)地尿液溢出的現(xiàn)象，其多在運(yùn)動(dòng)、咳嗽、打噴嚏等腹壓增大情況下發(fā)生，是全球中老年婦女常見(jiàn)病[1]，多發(fā)生于產(chǎn)褥期年輕婦女及老年婦女。國(guó)內(nèi)外臨床數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)女性尿失禁的患病率高達(dá)38%～49.2%，其中50%為SUI[2]，其每年用于治療尿失禁的費(fèi)用高達(dá)160億美元，甚至已超過(guò)了冠心病單病種在美國(guó)的醫(yī)療支出[3]；在中國(guó)，女性尿失禁患病率約為26.7%，其中SUI占18.6%[4]。在日常生活中，大部分SUI患者需長(zhǎng)期使用紙尿褲，可能還會(huì)有身體異味的存在，這些都使得他們產(chǎn)生沮喪、自卑、自我隔離的趨向，導(dǎo)致社交障礙，所以SUI又被稱(chēng)為“社交癌”，其嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量和身心健康。SUI的發(fā)病機(jī)制尚不明確，這導(dǎo)致臨床診斷、治療和預(yù)防都存在諸多困惑和爭(zhēng)議，故在現(xiàn)階段對(duì)SUI發(fā)病機(jī)制的研究尤為重要。本研究初步探討機(jī)械力對(duì)人陰道前壁成纖維細(xì)胞骨架及凋亡的影響及其在SUI發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2019年3月～2019年12月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦科行手術(shù)治療的患者17例，其中SUI患者10例(伴前壁脫垂或膀胱膨出，POP-Q Ⅲ～Ⅳ：Ba>+1)，其余7例為因良性腫瘤行子宮全切手術(shù)的患者。術(shù)中用冷刀切取兩類(lèi)患者手術(shù)標(biāo)本約0.5cm×0.5cm×0.5cm大的陰道前壁組織,4℃保存，并立即安排專(zhuān)人送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)的陰道前壁成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?；颊呔橥猓⒑炇鹬橥鈺?shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 主要儀器與試劑 四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)，流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡(Olympus)，鬼筆環(huán)肽(enzo life sciences，美國(guó))，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Biosciences，美國(guó))，人波形蛋白單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology,Inc,美國(guó))，小鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology,Inc.美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原代陰道成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 采用改良酶消化法培養(yǎng)原代細(xì)胞[5]，主要方法：將陰道前壁組織切成碎片(約1mm3)，置于培養(yǎng)瓶，用I型膠原酶和胰酶消化，再用含100U/mL青霉素和鏈霉素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨著時(shí)間推移，細(xì)胞會(huì)逐漸“爬出”，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代，本研究使用第3～6代生長(zhǎng)良好的成纖維細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞機(jī)械力加載 采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)對(duì)成纖維細(xì)胞施加機(jī)械應(yīng)變力。該裝置由驅(qū)動(dòng)控制單元、加載單元和應(yīng)變板組成，具體操作可見(jiàn)本課題組前期研究[6]。本研究對(duì)非SUI患者陰道前壁原代成纖維細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)加載，力學(xué)參數(shù)設(shè)置為2666με(加載位移為2mm)，頻率為0.1Hz，持續(xù)4h。

1.3.3 原代成纖維細(xì)胞鑒定 原代成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，免疫組化染色顯示波形蛋白陽(yáng)性，角蛋白陰性。本研究使用第3～6代穩(wěn)定的原代成纖維細(xì)胞，在室載玻片中培養(yǎng)至50%融合度，隨后洗滌、固定，用0.4% Triton X-100處理。用3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體(200μg/mL)和小鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(200μg/mL)孵育細(xì)胞，4℃過(guò)夜；用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。二抗孵育，用蘇木精染核。最后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 鬼筆環(huán)肽染色 用PBS沖洗各組成纖維細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞15min，用0.4% Triton X-100處理5min，再用FITC結(jié)合的鬼筆環(huán)肽在4℃下孵育各組成纖維細(xì)胞，過(guò)夜。次日用DAPI染細(xì)胞核，最后用熒光顯微鏡觀察鬼筆環(huán)肽染色的細(xì)胞面積，并用軟件Image-Pro Plus 6.0定量分析陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的面積。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 各組原代成纖維細(xì)胞用胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次后收集。用100μL結(jié)合緩沖液(Binding buffer)重新懸浮成纖維細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)把5μL的PE Annexin V和5μL的7-AAD添加到每組細(xì)胞中，輕柔混合，室溫避光孵育15min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床參數(shù)分析 3組患者的年齡、陰道分娩次數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組樣本臨床資料參數(shù)分析

2.2 成纖維細(xì)胞鑒定 免疫組化染色顯示,原代培養(yǎng)的細(xì)胞波形蛋白陽(yáng)性，角蛋白陰性。光學(xué)顯微鏡下觀察見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，符合成纖維細(xì)胞特點(diǎn)(圖1)。

圖1 原代成纖維細(xì)胞鑒定A～C：細(xì)胞熒光染色；D：原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞白片

2.3 細(xì)胞骨架染色 鬼筆環(huán)肽可使actin細(xì)胞骨架特異性染色，本研究中用于原代成纖維細(xì)胞的actin細(xì)胞骨架的染色，表示細(xì)胞骨架完整性，染色面積越小表明細(xì)胞骨架破壞程度越大。本研究結(jié)果顯示，與正常成纖維細(xì)胞相比，機(jī)械力加載的正常成纖維細(xì)胞的細(xì)胞骨架著色顯著減少(P<0.001)，表明細(xì)胞骨架受到破壞；并且SUI組的成纖維細(xì)胞著色顯著減少(P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 三組細(xì)胞細(xì)胞骨架檢測(cè)***P<0.001 vs CON組

2.4 細(xì)胞凋亡 與CON組成纖維細(xì)胞相比，機(jī)械力加載后的CMS組細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡的總體凋亡率顯著升高(P<0.001)；CMS組的凋亡率呈現(xiàn)出與SUI類(lèi)似的變化，見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)***P<0.001 vs CON組

2.5 細(xì)胞骨架與細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析 SUI組和CMS組中細(xì)胞的凋亡率升高，細(xì)胞骨架明顯受到破壞，且與CON組相比具有顯著差異。相關(guān)性分析顯示，SUI組和CMS組中細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞骨架的完整性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.8484，P=0.0158；r=-0.8964，P=0.0004)，見(jiàn)圖4。

圖4 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞骨架的相關(guān)性分析

3 討 論

SUI發(fā)生的病理生理機(jī)制至今尚未完全闡明。從解剖學(xué)水平分析，導(dǎo)致SUI發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制在于尿道支持功能減弱和尿道固有括約肌功能缺陷。盆底肌肉、韌帶及筋膜組織共同為尿道提供支持作用，筋膜和韌帶通過(guò)維持膀胱頸和尿道的位置及尿道的閉合以實(shí)現(xiàn)尿自禁功能。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為，盆底支持結(jié)構(gòu)松弛可導(dǎo)致SUI。大量臨床流行病學(xué)研究揭示[7-8]，年齡、妊娠、分娩、便秘、肥胖等均是SUI的致病因素。除了衰老引起盆底支持結(jié)構(gòu)退行性病變外，妊娠、便秘、肥胖可引起盆腹腔壓力增加導(dǎo)致的盆腔組織所受的機(jī)械力異常增高，引起盆腔機(jī)械損傷，從而產(chǎn)生慢性機(jī)械力作用效應(yīng)，最終提高了SUI的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而分娩則是急性機(jī)械力損傷的過(guò)程。當(dāng)腹部壓力的間歇性或持續(xù)性增加超過(guò)盆底肌肉收縮所產(chǎn)生的張力時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)疼痛、器官脫垂和SUI等癥狀和疾病[9]。因此，從宏觀層面上分析，盆底支持結(jié)構(gòu)經(jīng)受的機(jī)械力損傷可能是導(dǎo)致SUI發(fā)生的重要因素。

女性盆底組織受到各種力量的影響，包括重力、懷孕、分娩、咳嗽、排便和其他力量。健康成人平臥位腹壓在5～7mmHg(1mmHg=0.133kpa)之間，站立、日?；顒?dòng)、體力勞動(dòng)和舉重運(yùn)動(dòng)時(shí)腹壓增大。而POP患者骨盆底支撐組織中細(xì)胞的生物力學(xué)特性已被證實(shí)是異常的，提示POP是一種由骨盆底支撐組織生物力學(xué)特性進(jìn)行性下降引起的疾病[10]。細(xì)胞骨架重構(gòu)是細(xì)胞相應(yīng)機(jī)械力刺激的關(guān)鍵過(guò)程[11-12]。actin細(xì)胞骨架是由微絲組成的動(dòng)態(tài)變化的結(jié)構(gòu)，決定了細(xì)胞的形態(tài)和強(qiáng)度，在抵抗機(jī)械拉力方面起著重要作用[13]。最重要的是，細(xì)胞骨架重組促進(jìn)細(xì)胞外信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄，改變細(xì)胞周期和細(xì)胞形態(tài)[14]。女性盆底組織處于妊娠、分娩等腹壓變化的復(fù)雜生物力學(xué)環(huán)境中，盆底肌肉、韌帶產(chǎn)生的力平衡狀態(tài)是維持其正常結(jié)構(gòu)功能的基礎(chǔ)。故目前對(duì)于SUI發(fā)病的研究認(rèn)為，其發(fā)病的關(guān)鍵因素主要與盆底肌肉、韌帶及筋膜等支持結(jié)構(gòu)松弛密切相關(guān)[15]，而成纖維細(xì)胞則是盆底韌帶的重要組成部分。Kokcu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，盆底松弛的患者成纖維細(xì)胞數(shù)量較非脫垂患者顯著減少。既往實(shí)驗(yàn)也表明，損傷性機(jī)械力可明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖[17]，由此可見(jiàn)，盆底成纖維細(xì)胞數(shù)量減少是導(dǎo)致SUI發(fā)病的重要原因。此外，大量國(guó)內(nèi)外研究也表明SUI的發(fā)病與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的重構(gòu)有著密切關(guān)系[18-19]，而ECM的主要成分如膠原和細(xì)胞因子[20]等分泌與盆底成纖維細(xì)胞有著密不可分的聯(lián)系。由此可見(jiàn)，成纖維細(xì)胞的數(shù)量和功能在SUI發(fā)病中有著重要作用，成纖維細(xì)胞凋亡率增加勢(shì)必促進(jìn)SUI發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程。

本研究中，機(jī)械力加載正常成纖維細(xì)胞后不但破壞了成纖維細(xì)胞的actin細(xì)胞骨架，還引起了顯著的細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)出與SUI患者成纖維細(xì)胞類(lèi)似的特點(diǎn)，這在一定程度上說(shuō)明了成纖維細(xì)胞的actin細(xì)胞骨架的破壞和細(xì)胞凋亡可能均參與了SUI的發(fā)生發(fā)展。并且經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，SUI患者成纖維細(xì)胞或機(jī)械力加載后的正常成纖維細(xì)胞的actin細(xì)胞骨架的破壞程度與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。這也在某種程度上說(shuō)明了actin細(xì)胞骨架和細(xì)胞凋亡在SUI的發(fā)生發(fā)展中存在一定的聯(lián)系。此外，有報(bào)道證實(shí)actin細(xì)胞骨架傳統(tǒng)上被認(rèn)為是凋亡開(kāi)始時(shí)高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞骨架元素[21]，細(xì)胞骨架的一些重要變化參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程及相關(guān)信號(hào)的傳遞[22]。

SUI發(fā)病機(jī)制的闡明有助于我們更好地實(shí)施預(yù)防、診斷和治療措施，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。盆底功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction,PFD)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本團(tuán)隊(duì)前期已在多個(gè)角度對(duì)其進(jìn)行了探究，如氧化應(yīng)激、ECM等。本研究初步探討了actin細(xì)胞骨架和細(xì)胞凋亡在SUI發(fā)病中的作用，及兩者可能存在的關(guān)系，這些可能都參與了其發(fā)生發(fā)展，但具體作用方式還需進(jìn)一步研究。