曹 芹, 王 丹

(重慶市第九人民醫(yī)院, 1. 麻醉科, 2. 消化內(nèi)科, 重慶, 400700)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病早期沒有典型的臨床特征，很多患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)[1]。羅哌卡因具有鎮(zhèn)靜和麻醉作用，是首個(gè)純左旋長效酰胺類的麻醉藥，羅哌卡因可通過阻斷神經(jīng)細(xì)胞中的鈉離子通道，抑制鈉離子進(jìn)入神經(jīng)纖維細(xì)胞膜中，進(jìn)而阻滯神經(jīng)纖維內(nèi)的信號傳導(dǎo)[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因具有抗腫瘤作用，羅哌卡因能夠抑制宮頸癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞增殖。羅哌卡因處理后的食管癌細(xì)胞遷移能力降低[5]。已有實(shí)驗(yàn)[6]顯示，胃癌細(xì)胞經(jīng)羅哌卡因處理后細(xì)胞增殖能力下降，劃痕愈合能力降低，但目前對羅哌卡因通過何種機(jī)制發(fā)揮抗胃癌作用還不明確。

Wnt屬于分泌蛋白，可通過作用于細(xì)胞膜上的受體影響細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與細(xì)胞遷移、分化、增殖等過程[7]。目前在人以及鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Wnt的19個(gè)成員, β-catenin和Wnt1是Wnt信號通路的關(guān)鍵因子，二者表達(dá)水平與Wnt信號通路激活水平有關(guān)[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，Wnt在胃癌中過度激活，而抑制Wnt可減弱細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移能力。本研究探討羅哌卡因調(diào)控Wnt信號抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制，為明確羅哌卡因抗腫瘤機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體購自武漢博士德生物工程有限公司; 胃癌細(xì)胞NCI-N87購自美國ATCC; 基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體購自美國Cell Signaling Technology; Wnt1抗體購自美國Abcam; β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體購自南京建成生物工程研究所; 羅哌卡因購自宜昌人福藥業(yè)(國藥準(zhǔn)字H20103636); 上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司; BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司; 鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體購自美國Proteintech。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

用0、160、320、640 μg/mL羅哌卡因細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，記為對照組、ROP-L組、ROP-M組、ROP-H組; 用含有25 mmol/L的Wnt信號激活劑Licl和640 μg/mL羅哌卡因的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，記為ROP-H+Licl組，以ROP-H組為參照。

1.3 MTT檢測羅哌卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖影響

胃癌細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM中進(jìn)行，細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)為: 37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)箱。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞按照每個(gè)孔內(nèi)添加4 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)孔內(nèi)添加100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，分別在細(xì)胞中添加羅哌卡因，使羅哌卡因終濃度為0、40、80、160、320、640 μg/mL, 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在每個(gè)孔內(nèi)添加10 μL的MTT溶液，繼續(xù)放在37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)2 h。棄掉孔中的液體，繼續(xù)添加150 μL的二甲基亞砜溶液，孵育10 min后，立即用酶標(biāo)儀測定每個(gè)孔在450 nm的吸光度值(OD)。以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性。

1.4 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn): 對照組、ROP-L、ROP-M、ROP-H、ROP-H+Licl組細(xì)胞分別用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸浮液。每個(gè)檢測樣品吸取0.2 mL至Transwell小室的上室內(nèi)，同時(shí)吸取0.6 mL的含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液至下室內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。將小室取出，用棉簽擦掉基質(zhì)膠以及沒穿膜的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，添加95%的乙醇固定15 min, 用結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)遷移數(shù)量，平均值為結(jié)果。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)具體操作如下: 對照組、ROP-L、ROP-M、ROP-H、ROP-H+Licl組細(xì)胞分別用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸浮液。把matrigel放在4 ℃融化，吸取50 μg的matrigel添加到95 μL的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，將稀釋以后的matrigel添加到Transwell小室內(nèi)，轉(zhuǎn)移到37℃孵育1 h。分別取0.2 mL的培養(yǎng)液加入到Transwell小室的上室內(nèi)，同時(shí)吸取0.6 mL的含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液至下室內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 d。將小室取出，利用棉簽擦掉基質(zhì)膠以及沒穿膜的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，添加95%的乙醇穩(wěn)固15 min, 隨后使用結(jié)晶紫進(jìn)行染色。任意選取5個(gè)角度，使用顯微鏡完成侵襲數(shù)目計(jì)算，結(jié)果取平均值。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin、Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)

對照組、ROP-L、ROP-M、ROP-H、ROP-H+Licl組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，分別在細(xì)胞中加入含有1% PMSF的RIPA溶液，置于冰上裂解30 min, 轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，以4 ℃、12 000 g離心15 min, 小心吸取上清，分裝，以BCA方法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳采用10%分離膠、5%濃縮膠。把2×Loading Buffer添加到蛋白溶液中，在100 ℃的前提下孵化5 min。每個(gè)上樣孔中均分別加入30 μg蛋白樣品，電泳使用70 V的電壓，觀察染料到達(dá)分離膠時(shí)，調(diào)整電壓為100 V繼續(xù)電泳，觀察溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的下端時(shí)，終止電泳。把凝膠取出，裁剪合適大小的NC膜，放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡備用。設(shè)置200 mA恒流、冰上轉(zhuǎn)膜50 min。把NC膜置于5%牛血清白蛋白內(nèi)，于室溫環(huán)境孵育2 h。將1∶1 000一抗溶液稀釋后放入NC膜，放在4 ℃孵化一整晚。最后將二抗溶液1∶4 000稀釋后浸泡NC膜，放在37 ℃結(jié)合2 h。按照ECL方法顯色。將GAPDH設(shè)置為參照，分析條帶的灰度值，以灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 羅哌卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖影響

相較于0、40、80 μg/mL羅哌卡因處理后的胃癌細(xì)胞增殖活性[(0.67±0.08)、(0.68±0.06)、(0.65±0.05)], 160、320、640 μg/mL羅哌卡因處理后的胃癌細(xì)胞增殖活性降低[(0.50±0.04)、(0.42±0.03)、(0.35±0.03)]。選擇160、320、640 μg/mL的羅哌卡因進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 羅哌卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞遷移和侵襲影響

與對照組比較, ROP-L、ROP-M、ROP-H組胃癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目逐漸減少以及細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。羅哌卡因抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，見圖1、表1。

表1 羅哌卡因處理后的胃癌細(xì)胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和細(xì)胞中MMP-9、MMP-2蛋白水平

2.3 羅哌卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)影響

與對照組比較, ROP-L組、ROP-M組、ROP-H組胃癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平逐漸升高, N-cadherin蛋白表達(dá)水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。羅哌卡因抑制胃癌細(xì)胞的EMT, 見圖2、表2。

表2 羅哌卡因處理后的胃癌細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin蛋白水平

2.4 羅哌卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞中Wnt信號通路影響

與對照組比較, ROP-L組、ROP-M組、ROP-H組胃癌細(xì)胞中Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。羅哌卡因抑制胃癌細(xì)胞的Wnt信號通路，見圖3、表3。

表3 羅哌卡因處理后的胃癌細(xì)胞Wnt1、β-catenin蛋白水平

2.5 Wnt信號激活劑Licl對羅哌卡因抑制胃癌細(xì)胞Wnt信號通路的作用

與ROP-H組比較, ROP-H+Licl組胃癌細(xì)胞中Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表4。

表4 Wnt信號激活劑Licl和羅哌卡因處理后的胃癌細(xì)胞Wnt1、β-catenin蛋白水平

2.6 激活Wnt信號對羅哌卡因影響胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT作用

與ROP-H比較, ROP-H+Licl組胃癌細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目升高, MMP-9、MMP-2、N-cadherin蛋白水平升高, E-cadherin蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、表5。

表5 Wnt信號激活劑Licl和羅哌卡因處理后的胃癌細(xì)胞增殖活性、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和MMP-9、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平

A: 胃癌細(xì)胞NCI-N87的遷移侵襲(放大倍數(shù)200倍); B: MMP-9、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)。

3 討 論

羅哌卡因是純S(-)型鏡像體結(jié)構(gòu)，為常見的臨床麻醉藥。近些年來，羅哌卡因在腫瘤中的作用引起廣泛重視[10]。有實(shí)驗(yàn)[3-5]發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因?qū)m頸癌、肝癌、食管癌等多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，且羅哌卡因還可在體外抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。羅哌卡因?qū)ξ赴┮灿幸种谱饔茫涮幚砗蟮奈赴┘?xì)胞增殖能力降低，劃痕愈合能力下降[6, 11]。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因可降低胃癌細(xì)胞增殖活性，抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲，這說明羅哌卡因有抗胃癌轉(zhuǎn)移的作用，與既往研究結(jié)果相符合。

腫瘤的轉(zhuǎn)移過程十分復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移至新的組織和器官時(shí)，能夠合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，破壞細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供條件[12-13]?；|(zhì)金屬蛋白酶是常見的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，其蛋白成員很多，分別能夠?qū)⒉煌募?xì)胞外基質(zhì)組分降解，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供條件[14]。基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員有MMP-2和MMP-9, 基質(zhì)金屬蛋白酶在腫瘤中的表達(dá)有所增加后，會(huì)加速腫瘤細(xì)胞的遷移[15]。EMT是指細(xì)胞上皮特征逐漸消失而間質(zhì)細(xì)胞特征逐漸明顯的過程，在胚胎發(fā)育、組織生長等過程中均有EMT現(xiàn)象[16]。E-cadherin是上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白，其在EMT過程中表達(dá)下調(diào)。N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，其表達(dá)水平升高標(biāo)志著EMT水平增加[17]。腫瘤相關(guān)研究[18]顯示, EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志事件，腫瘤細(xì)胞EMT后遷移和侵襲能力增加。本研究顯示，胃癌細(xì)胞經(jīng)羅哌卡因處理后, MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)水平均有所降低, E-cadherin蛋白表達(dá)水平減少, N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，這說明羅哌卡因阻滯胃癌細(xì)胞EMT, 制止胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和入侵，這與細(xì)胞侵襲的研究結(jié)果相符。

雖然已經(jīng)明確了羅哌卡因具有抗腫瘤作用，但目前尚不清楚羅哌卡因的作用機(jī)制。既往實(shí)驗(yàn)[3, 5, 11]發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因抗腫瘤作用與信號通路如JNK、ERK、STAT3等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因處理后的胃癌細(xì)胞中Wnt1、β-catenin蛋白水平降低。Wnt1、β-catenin是Wnt信號通路的關(guān)鍵因子，二者表達(dá)水平升高后標(biāo)志著Wnt信號通路被激活[19]。Wnt是在人體組織中具有多種生物學(xué)作用的信號通路，在能量代謝、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞增殖等多個(gè)生理過程中發(fā)揮作用[20]。研究[21-22]證明腫瘤組織中Wnt信號過度激活，Wnt信號可激活細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Wnt激活增加胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT水平，而抑制Wnt信號可降低胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移能力[23]。本研究顯示，羅哌卡因降低胃癌細(xì)胞中Wnt激活水平，并且Wnt信號激活劑可逆轉(zhuǎn)羅哌卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖、遷移、侵襲以及EMT的作用，提示羅哌卡因通過Wnt發(fā)揮作用。

綜上所述，羅哌卡因通過下調(diào)Wnt激活水平抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT, 可為后續(xù)研究羅哌卡因抗胃癌作用機(jī)制提供參考。此外，羅哌卡因通過何種靶向機(jī)制影響Wnt進(jìn)而調(diào)控胃癌還有待進(jìn)一步研究。