魚(yú)源維氏氣單胞菌的研究進(jìn)展

熊廣澤，張 焱

(1.武漢外國(guó)語(yǔ)學(xué)校,湖北 武漢 430022; 2.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430079)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)又稱(chēng)維羅納氣單胞菌，為水傳播性的兼性厭氧菌[1]。氣單胞菌屬中的致病菌能導(dǎo)致水生、牲畜以及人類(lèi)患病。維氏氣單胞菌對(duì)水生變溫動(dòng)物感染性高，該菌感染魚(yú)類(lèi)后，魚(yú)體往往表現(xiàn)出多種病癥，如出血、敗血癥等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。當(dāng)前已在我國(guó)部分地區(qū)對(duì)漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了較大經(jīng)濟(jì)損失。這類(lèi)致病菌越來(lái)越受到人們的關(guān)注。維氏氣單胞菌的主要毒力因子主要有三類(lèi),分別為外毒素，胞外酶和黏附因子。目前在各文獻(xiàn)上存在部分毒力因子劃分混亂和同物異名的問(wèn)題，需要勘正。

筆者旨在對(duì)維氏氣單胞菌的最新研究進(jìn)展進(jìn)行報(bào)道，總結(jié)氣單胞菌毒力因子的劃分、名稱(chēng)和相關(guān)基因，從而為在水產(chǎn)養(yǎng)殖中預(yù)防和治療此類(lèi)細(xì)菌病和今后對(duì)維氏氣單胞菌的毒性研究提供一定的參考依據(jù)。

1 維氏氣單胞菌的分類(lèi)地位和生物學(xué)特性

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)，是兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌。在科級(jí)分類(lèi)階元上，目前尚無(wú)定論，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為歸屬弧菌科(Vibrionaceae)[2]，也有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)該歸入專(zhuān)有的科——?dú)鈫伟?Aeromonadaceae)[1,5,6]氣單胞菌屬總共包含17[7]個(gè)種，如維氏氣單胞菌(A.veronii)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)等。氣單胞菌可以以有無(wú)運(yùn)動(dòng)活性為判斷標(biāo)準(zhǔn)，劃分為無(wú)運(yùn)動(dòng)力的嗜冷型和有運(yùn)動(dòng)力的嗜溫型[1,7,8]。維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌都屬于后者。氣單胞菌屬中的致病菌為人-畜-魚(yú)共患的致病菌。維氏氣單胞菌的DNA序列總長(zhǎng)度中位數(shù)為4.62Mb。通過(guò)對(duì)維氏氣單胞菌泛基因組(pan-genome)組的研究，結(jié)果表明其全基因組大小為7 214個(gè)基因[9]。

作為一種能感染陸生和水生動(dòng)物的病原菌，在溫度上，維氏氣單胞菌的適宜生長(zhǎng)溫度為25～30℃。在酸堿度上，能夠耐受高pH的環(huán)境。這就造成了該菌分布廣泛，在自然水體、泥土乃至水生動(dòng)物的體內(nèi)普遍存在[1,2,8]，特別是在較炎熱的夏季，分離得到的數(shù)量最多[10]。又因?yàn)槠渚昴茉谄胀ū涞?～4℃低溫下/pH 4～10酸堿環(huán)境/高鹽濃度的條件下生長(zhǎng)，所以在不同種類(lèi)的食品中亦發(fā)現(xiàn)存在其菌株，如海鮮以及衍生加工食品等[11]。

2 維氏氣單胞菌的致病性

氣單胞菌是魚(yú)類(lèi)和水生動(dòng)物的重要病原體，能夠通過(guò)食物感染人類(lèi)和其他動(dòng)物。維氏氣單胞菌中的有毒菌株的致病性較強(qiáng)，主要感染各種淡水魚(yú)類(lèi)，如鯉魚(yú)、羅非魚(yú)等[2]。染菌可引起患病魚(yú)類(lèi)表現(xiàn)出敗血癥、出血、潰瘍、腹水和高死亡率癥狀，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12,13,14]。在2009-2014年，張德鋒等對(duì)華南地區(qū)的70個(gè)魚(yú)塘里捕獲的患病的草魚(yú)、鯽魚(yú)和鱖魚(yú)等15種魚(yú)類(lèi)進(jìn)行研究。在該研究中，從上述多種患病魚(yú)類(lèi)體內(nèi)分離鑒定出的143株氣單胞菌中，有維氏氣單胞菌80株，占比56%(80/143)，出現(xiàn)比例在所有氣單胞菌中最高，且將不同氣單胞菌通過(guò)浸浴感染法和腹腔注射法比較研究各菌的毒力，在浸染模型中，表現(xiàn)出最強(qiáng)毒力的是維氏氣單胞菌[3]。在國(guó)外，維氏氣單胞菌引起的大規(guī)模養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)死亡同樣較常見(jiàn)，如造成2017年夏季在埃及塞得港省(Port Said)養(yǎng)魚(yú)場(chǎng)尼羅羅非魚(yú)(O.niloticus)大量死亡的主要原因即是由維氏氣單胞菌感染而引起的發(fā)炎潰瘍和敗血癥[15]。Sabrina Hossain等從52條患病觀賞虹鳉(P.reticulata)中分離出5種氣單胞菌，其中從34條中分離出維氏氣單胞菌，占比65%，出現(xiàn)比例在所有氣單胞菌中最高[16]。

維氏氣單胞菌不但可以感染包括魚(yú)類(lèi)在內(nèi)的水生動(dòng)物，也可感染包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。維氏氣單胞菌對(duì)人而言是一種機(jī)會(huì)致病菌[1]，不過(guò)對(duì)免疫功能健全的人也具有一定的感染性[17]。氣單胞菌導(dǎo)致的最常見(jiàn)的疾病是腸胃炎癥，尤其是對(duì)于低齡嬰幼兒，可以導(dǎo)致不同嚴(yán)重程度的腹瀉[2]。而該菌導(dǎo)致的其他病癥包括敗血癥、肺炎等呼吸道感染以及零星的腦膜炎和偶見(jiàn)溶血性尿毒綜合征、急性化膿性關(guān)節(jié)炎[18,19〗等，在人體內(nèi)的各種感染多為消化道、呼吸道、淺表皮向循環(huán)系統(tǒng)的擴(kuò)散引起的[20]。

由維氏氣單胞菌引起的病例，自1994年報(bào)道出第一例后屢有出現(xiàn)。近年來(lái)，被維氏氣單胞菌感染的病例報(bào)導(dǎo)日益增多[20,21]，對(duì)公共衛(wèi)生和人類(lèi)生命健康造成一定的威脅。

3 維氏氣單胞菌的主要毒力因子

3.1 外毒素

外毒素(exotoxin),即胞外毒素，包括氣溶素(aerolysin)和腸毒素(enterotoxin)等。這些毒素都是可認(rèn)為屬于同一基因家族的具有相似結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的單一多肽[8,22]。

氣溶素又名溶血性外毒素[22]，或簡(jiǎn)稱(chēng)溶血素(haemolysin)，相關(guān)基因主要有三個(gè)，分別是aerA，大小為431 bp[2]；ahh1[23]，大小為130 bp；asa1[23]，大小為375 bp。氣溶素可作為菌株有無(wú)致病性的標(biāo)志。氣溶素具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒性。氣溶素的生物功能為結(jié)合并破壞受侵染組織細(xì)胞的細(xì)胞膜，甚至造成受侵染細(xì)胞的死亡[24]。

腸毒素是維氏氣單胞菌的主要毒力因子，也被稱(chēng)為細(xì)胞毒性腸毒素(cytolytic enterotoxin)，相關(guān)基因主要有三個(gè)，分別是act，ast和alt[23]。分泌腸毒素的菌株經(jīng)?？梢詮母篂a的病人中分離得到。腸毒素又可分為細(xì)胞溶解性腸毒素和細(xì)胞興奮性腸毒素兩類(lèi)[1,2]。細(xì)胞毒性腸毒素的毒性表現(xiàn)在促使小腸隱窩和絨毛的退化。細(xì)胞興奮性腸毒素不會(huì)導(dǎo)致上皮退化,而是刺激腸道加強(qiáng)分泌作用，最終導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞廣泛性損傷。

3.2 胞外酶

胞外酶(extracellular enzyme)，是泛指在細(xì)胞外分泌的酶，以分泌游離程度可分為質(zhì)膜鑲嵌型、存在于質(zhì)膜空間的和擴(kuò)散型即完全脫離菌體的。對(duì)于氣單胞菌，胞外酶包括絲氨酸蛋白酶(serine protease)，相關(guān)基因?yàn)閍hpA；彈性蛋白酶(elastase)，相關(guān)基因?yàn)閍hpB；脂酶(lipase)，相關(guān)基因?yàn)閘ip[23]。還包括Dnase和幾丁質(zhì)酶等，胞外酶皆由母體菌分泌。胞外酶在氣單胞菌感染宿主的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，直接致病或活化其他致病因子以致病[25]。其中，蛋白酶可以直接或間接由蛋白水解激活從而損傷宿主組織[11]。

3.3 黏附素

黏附素(adhesin)又名黏附因子，許多微生物都含有該結(jié)構(gòu)，細(xì)菌侵染的重要先決步驟即是通過(guò)黏附素黏附及定植在宿主黏膜上。氣單胞菌的黏附素分為兩類(lèi):菌毛黏附素(纖維狀黏附素)(fimbrial adhesin)和非菌毛黏附素(外膜蛋白相關(guān)的黏附素)(afimbrial adhesin)。細(xì)分包含菌毛、莢膜、細(xì)胞壁脂多糖、S-層蛋白、外膜蛋白等[26]。

菌毛(fimbriae)是一種具有黏附功能的細(xì)胞器，是細(xì)菌表面由菌毛蛋白亞基構(gòu)成的絲狀結(jié)構(gòu)。氣單胞菌的菌毛可附著于宿主黏膜上皮細(xì)胞的相應(yīng)受體上，便于氣單胞菌的局部性增殖或繼續(xù)侵染。同時(shí)，菌毛還可進(jìn)行其他的細(xì)胞活動(dòng)，如菌體的聚集、對(duì)宿主細(xì)胞的浸潤(rùn)和菌體的運(yùn)動(dòng)等[1]。

莢膜(capsule)是由多糖構(gòu)成并覆益在細(xì)菌細(xì)胞外膜上一層黏液層，位于細(xì)菌細(xì)胞的最外層，高度水合,并可形成同型和異型聚合物。這些結(jié)構(gòu)經(jīng)常形成,故能參與細(xì)菌與環(huán)境的相互作用。莢膜已經(jīng)被鑒定為許多病原菌的主要毒力因子,因具有抗吞噬和抗體液殺菌物質(zhì)的能力，有助于細(xì)菌的存活[27],并有助于入侵魚(yú)類(lèi)的細(xì)胞[28]。

細(xì)胞壁脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，一種表面多糖結(jié)合物，由脂質(zhì)、核心寡糖和特定多聚糖或O抗原組成[25,29]，LPS也叫內(nèi)毒素[14]。為革蘭氏陰性菌所特有。LPS是革蘭氏陰性菌外膜外小葉的主要成分，是非特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)因子，可引起內(nèi)源性介質(zhì)的形成和釋放從而造成局部炎癥。大部分嗜溫氣單胞菌的LPS會(huì)引起敗血癥和腸胃炎[2]

S-層蛋白(S layer protein，Slps)是多種細(xì)菌被膜最外面的一層亞晶狀蛋白層，化學(xué)本質(zhì)為糖蛋白或單一蛋白[1]，分子量40～200 kDa。Slps暴露在細(xì)菌最外層，具有黏附、抗補(bǔ)體途徑和抗吞噬細(xì)胞吞噬等功能[26]。此外，Slps和菌毛亦是噬菌體的結(jié)合位點(diǎn)。

外膜蛋白(outer membrane protein，OMPs)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中特有的結(jié)構(gòu)，具有革蘭氏陰性孔蛋白的典型特征，包括酸性的pI，高甘氨酸和低脯氨酸含量，無(wú)半胱氨酸殘基和羧基末端Phe。OMPs的細(xì)胞功能與物質(zhì)運(yùn)輸、保持菌體形態(tài)等有關(guān)[30]，且具有良好的免疫原性。維氏氣單胞菌主要的OMP為分子量38 kDa的OMP38，相關(guān)基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?047bp，編碼349aa的一級(jí)蛋白質(zhì)，成熟的蛋白質(zhì)為329aa[31]。作為細(xì)菌的一種致病因子，與Slps類(lèi)似，OMPs同樣具有黏附、抗血清殺菌、抗補(bǔ)體和抗吞噬的功能，在細(xì)菌的致病過(guò)程中起重要作用。如OMP A即是維氏氣單胞菌重要的黏附素[30]，ompA含有ompAⅠ-ompAⅡ串聯(lián)同系物[24]。

毒力因子的預(yù)測(cè)表明，維氏氣單胞菌與近源種嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌之間沒(méi)有顯著差異[9]。氣單胞菌致病株并非總是含有上述所有的毒力因子基因，每個(gè)氣單胞菌致病株可具有1～7個(gè)毒力因子相關(guān)基因，維氏氣單胞菌致病株常見(jiàn)的毒力因子基因組成模式為(aerA+exu+lip+flaA/B+alt+)[32]。

4 維氏氣單胞菌的藥敏性及展望

就維氏氣單胞菌等氣單胞菌的藥敏性而言，從相應(yīng)病魚(yú)中分離出的所有氣單胞菌菌株對(duì)氨芐青霉素的耐藥性為92%[33]～100%[22]，對(duì)青霉素的耐藥性約為100%[22]，對(duì)頭孢菌素的耐藥性為86.7%，對(duì)羧芐青霉素的耐藥性為62.2%，對(duì)紅霉素的耐藥性為40.0%[22]。對(duì)其他常見(jiàn)抗生素如阿莫西林、亞胺培南、萘啶酸、土霉素和利福平的耐藥性均超過(guò)70.0%[16]。當(dāng)前最有效的抗菌藥物是環(huán)丙沙星，近100%的菌株敏感[25]。而大多數(shù)被測(cè)菌株在1.2 mg·L-1的氯濃度下均未被殺[25]。

氣單胞菌目前因較頻繁地在夏季于漁業(yè)水產(chǎn)魚(yú)塘及實(shí)驗(yàn)室集約養(yǎng)殖條件下的魚(yú)缸中暴發(fā)，從而日益受到全球各項(xiàng)研究的重視，而維氏氣單胞菌正是一種在各項(xiàng)研究中被確認(rèn)為對(duì)魚(yú)類(lèi)浸浴感染時(shí)致病性很強(qiáng)的致病菌。目前，實(shí)驗(yàn)室研究A.veronii對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒力影響的材料常見(jiàn)的是斑馬魚(yú)。維氏氣單胞菌對(duì)斑馬魚(yú)的發(fā)育毒害反映在從胚胎到成魚(yú)的各個(gè)時(shí)期。斑馬魚(yú)很容易被維氏氣單胞菌感染，由Phelps等人在2017年的研究數(shù)據(jù)表明，氣單胞菌和弧菌是在普通幼魚(yú)中存在的兩個(gè)最主要的屬，52.2%的6 DPF(受精后6日)時(shí)期仔魚(yú)體內(nèi)被檢測(cè)出感染了氣單胞菌[34]。成魚(yú)時(shí)，維氏氣單胞菌對(duì)斑馬魚(yú)的毒害則主要表現(xiàn)為出血、潰瘍、敗血癥等，與多種疾病有關(guān)[35〗?？杀憩F(xiàn)為腸上皮細(xì)胞增殖增多，質(zhì)量異常[36]。有研究表明，維氏氣單胞菌會(huì)造成斑馬魚(yú)的免疫應(yīng)答異常性增高[37]。由此看來(lái)，可能是維氏氣單胞菌的外毒素、胞外酶等毒力因子影響了魚(yú)類(lèi)的腸道和黏膜從而引發(fā)了成魚(yú)的后天免疫應(yīng)答升高、病癥的產(chǎn)生甚至死亡。

以維氏氣單胞菌占比多的數(shù)種不同的氣單胞菌的混合感染是導(dǎo)致魚(yú)塘魚(yú)暴發(fā)敗血癥等疾病的常見(jiàn)原因，因此建議在漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖和實(shí)驗(yàn)室集約養(yǎng)殖中，應(yīng)定期消毒，保持水體衛(wèi)生，減少魚(yú)體密度，適時(shí)曬塘洗缸，正確給藥，在夏季應(yīng)加強(qiáng)水體監(jiān)控，適量補(bǔ)藥，合理養(yǎng)殖，從而預(yù)防維氏氣單胞菌等引起的魚(yú)類(lèi)病害。