血紅素加氧酶和膽綠素還原酶反應(yīng)化學(xué)研究進(jìn)展

池肇春

山東省青島市市立醫(yī)院消化科 (山東 青島， 266035)

1 概述

在哺乳動(dòng)物中，血紅素的分解代謝必不可少。血紅素首先被血紅素加氧酶(HO)裂解成線性四吡咯膽綠素Ⅸα(BV Ixα)，然后由膽綠素還原酶(BVR)轉(zhuǎn)化為膽紅素。HO利用NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶(CPR)提供的3個(gè)氧分子(O2)和7個(gè)電子打開血紅素環(huán)，BVR通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)降低膽綠素。HOs的結(jié)構(gòu)研究，包括底物結(jié)合、反應(yīng)中間結(jié)合和幾種特定的抑制劑結(jié)合形式，揭示了底物與HO結(jié)合的細(xì)節(jié)和HO反應(yīng)過程的機(jī)制。低溫捕獲結(jié)構(gòu)和檢測(cè)遠(yuǎn)端配體與血紅素鐵之間鍵的光解的時(shí)間分辨光譜研究表明，在HO反應(yīng)過程中產(chǎn)生的CO是如何從反應(yīng)位點(diǎn)解離的，HO的構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)的變化。含有HO和CPR的復(fù)合物結(jié)構(gòu)提供了電子如何轉(zhuǎn)移到血紅素HO絡(luò)合物的詳細(xì)信息。盡管BVR及其與NAD+的配合物的三級(jí)結(jié)構(gòu)早在10多年前就已確定，但其催化殘基和反應(yīng)機(jī)制仍不清楚。最近的一項(xiàng)關(guān)于藍(lán)細(xì)菌BVR與NADP+和底物BV的結(jié)晶學(xué)研究澄清了這些問題。兩個(gè)BV分子以堆積的方式與BVR結(jié)合，其中一個(gè)BV可以協(xié)助另一個(gè)BV的還原催化。最新生化、光譜和晶體學(xué)的研究，詳述了化學(xué)基礎(chǔ)上的分子機(jī)理的HO和BVR反應(yīng)[1]。HO特異地切割血紅素的α位置，生成BV，F(xiàn)e2+的線性四吡咯和CO。近年來，CO和NO都被認(rèn)為是重要的信號(hào)分子。

CO通過NF-κB通路參與炎癥、細(xì)胞增殖和分化。該分子通過半胱氨酸β合成酶途徑還調(diào)節(jié)血管擴(kuò)張和血管收縮。通過神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2(NPAS 2)途徑調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律,并存在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化凋亡、腫瘤生長(zhǎng)抑制等多方面作用[2，3]。

哺乳動(dòng)物HO由一個(gè)可溶性催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C末端膜結(jié)合段組成。HO與底物血紅素形成1∶1復(fù)合物，并將其轉(zhuǎn)化為BV。具體而言，從血紅素轉(zhuǎn)化為α-羥基血紅素，再從α-羥基血紅素轉(zhuǎn)化為α膽綠蛋白血紅素(α-verdoheme)，最后從α-verdoheme轉(zhuǎn)化為BV[4]。第二步和第三步分別釋放CO和黑色鐵。哺乳動(dòng)物HO需要電子來進(jìn)行這些單加氧酶反應(yīng)，這些電子由NADPH-細(xì)胞色素P 450氧化還原酶(CPR)提供。

如果膽紅素不被氧化為膽綠素，則UDP-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)與肝細(xì)胞中的葡萄糖醛酸結(jié)合，使其更易溶于膽汁。結(jié)合膽紅素通過ATP依賴的多藥耐藥蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP[5]，一旦進(jìn)入腸道，結(jié)合膽紅素就會(huì)被微生物區(qū)系還原為尿膽紅素原，并進(jìn)一步代謝為甾體比林或尿比林，它們分別在糞便和尿液中排泄[5-7]。然而，膽紅素并不僅僅是血紅素分解代謝的廢物，它也是一種有效的抗氧化劑，特別是保護(hù)脂質(zhì)免受氧化。在過去的10年里，膽紅素的作用已經(jīng)擴(kuò)大，為一種炎癥保護(hù)的工具[8，9], 包括糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征、肥胖等疾病，特別是慢性肝病。據(jù)報(bào)道，在接受常規(guī)健康篩查的患者中，血清總膽紅素水平升高與代謝相關(guān)脂肪性肝病(MAFLD)和代謝相關(guān)脂肪性肝炎(MASH)呈負(fù)相關(guān)[10]。在肥胖兒童中，經(jīng)肝臟超聲診斷為MAFLD者血清總膽紅素水平低于無MAFLD者。Puri等[11]調(diào)查診斷為MAFLD的兒童，觀察到MASH患者血清總膽紅素水平顯著降低,此外，血清總膽紅素水平與脂肪變性程度和MAFLD活性評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。這些研究支持膽紅素對(duì)慢性肝病的進(jìn)展和發(fā)展起到保護(hù)作用。

2 HO的性質(zhì)

哺乳動(dòng)物HOs是一種重約33 kDa的蛋白質(zhì)，C末端段錨定在微粒體膜上，截短的可溶性HO形成單體。該蛋白有兩種亞型，即HO-1和HO-2。HO-1在脾臟和肝臟中高表達(dá)，主要由衰老的紅細(xì)胞降解血紅素。HO-2對(duì)HO-1的誘導(dǎo)劑完全不敏感，在大腦和睪丸中都有表達(dá)。藍(lán)藻和植物的HOs是可溶性蛋白，以多種亞型形式存在。

HO在特定的位置與血紅素結(jié)合，形成血紅素-HO配合物，然后激活分子氧(O2)使用底物血紅素。HO的血紅素配合物具有與其他血紅素蛋白類似的光譜性質(zhì)，如肌紅蛋白和血紅蛋白[12]。鐵血紅素-HO配合物在中性pH下以六配位高自旋態(tài)存在，經(jīng)Raman光譜和EPR(電子順磁共振)光譜分析，在堿性pH下轉(zhuǎn)變?yōu)榈妥孕龖B(tài)[13]。保守的殘基位于N端附近，被認(rèn)為是血紅素鐵的配體。血紅素-HO的一個(gè)特點(diǎn)是它對(duì)CO的親和力與O2的親和力幾乎相等。眾所周知，其他血紅素蛋白如肌紅蛋白和血紅蛋白對(duì)CO的親和力遠(yuǎn)高于O2。激活O2是HO反應(yīng)的關(guān)鍵過程。HO是一種α螺旋蛋白。血紅素群被A-、B-和F-螺旋包圍，血紅素鐵由His殘基(大鼠HO和人HO中His 25)在A-螺旋中協(xié)調(diào)。F螺旋位于血紅素的遠(yuǎn)端。有趣的是，血紅素的遠(yuǎn)端沒有側(cè)鏈，與血紅素鐵最接近的殘基是甘氨酸。晶體結(jié)構(gòu)分析表明水分子或OH-在鐵血紅素結(jié)合狀態(tài)下與血紅素鐵配位。血紅素的取向是由HO的堿基殘基與兩個(gè)血紅素丙酸基團(tuán)之間的靜電相互作用維持的。對(duì)電子密度圖的仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)，血紅素的一小部分在連接α和γ位置的軸心周圍以倒轉(zhuǎn)的方式與HO結(jié)合，這與核磁共振分析結(jié)果是一致的[9]。

3 血紅素結(jié)合對(duì)HO結(jié)構(gòu)的影響

在大鼠載脂蛋白血紅素加氧酶-1(apoHO-1)的晶體結(jié)構(gòu)中，血紅素結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了較大的構(gòu)象變化。用核磁共振技術(shù)測(cè)定了大鼠HO-1的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)，闡明了HO-1識(shí)別血紅素的機(jī)制[14]。核磁共振弛豫實(shí)驗(yàn)表明，在晶體結(jié)構(gòu)中，大鼠apoHO-1A-、B-和F-螺旋發(fā)生波動(dòng)，并與表面暴露環(huán)(CD-環(huán))和CD-環(huán)瞬間形成部分展開結(jié)構(gòu)。波動(dòng)的CD-環(huán)位于血紅素結(jié)合位點(diǎn)的17個(gè)以上，這個(gè)環(huán)的功能是未知的。在試圖闡明這一環(huán)的功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)有趣的突變改變了活動(dòng)，但幾乎沒有引起構(gòu)象的變化。CD環(huán)中苯丙氨酸79丙氨酸(Phe79Ala)突變通過促進(jìn)構(gòu)象波動(dòng)調(diào)節(jié)血紅素結(jié)合的構(gòu)象變化。此外， CD-環(huán)接近CPR在CPR-HO復(fù)合體中的交互位置。因此，血紅素與HO-1的結(jié)合可能通過控制血紅素結(jié)合位點(diǎn)和CD環(huán)的波動(dòng)而影響CPR與HO-1的親和力。

4 CO或氰化物結(jié)合血紅素引起的構(gòu)象變化

血紅素與Lys 179之間發(fā)生氫鍵的斷裂。此外，在CO結(jié)合的血紅素-大鼠HO-1晶體中，當(dāng)Fe-CO鍵被光解時(shí)，觀察到遠(yuǎn)端F-螺旋和血紅素鐵的反構(gòu)象變化[15]。用時(shí)間分辨共振拉曼光譜觀察了血紅素-血紅素-HO-1配合物在CO解離后的這種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化[16]。在亞納秒和微秒時(shí)間分別觀察到組氨酸鐵(Fe-His)拉伸和丙酸血紅素彎曲共振拉曼譜帶的時(shí)間變化。這些變化表明，在CO解離后，F(xiàn)e-His鍵的結(jié)構(gòu)重排和血紅素丙酸鹽橋的結(jié)構(gòu)重排。Fe-His拉伸模式在解離后表現(xiàn)出高達(dá)30 μ的上移，這是第1個(gè)例子，在CO解離引起的伸展Fe-His連接在血紅素蛋白。

5 BV鐵螯合配合物HO的結(jié)構(gòu)

當(dāng)HO反應(yīng)第3步完成時(shí)，生成血紅素裂解產(chǎn)物BV-鐵螯合物，從HO中釋放出Fe2+和BV。測(cè)定了BV-鐵螯合鐵結(jié)合大鼠HO-1的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)BV-鐵螯合鐵的四吡咯部分呈扭曲的U形構(gòu)象(zzz、sss構(gòu)型)[17]。在電子密度圖中未發(fā)現(xiàn)暴露于表面的丙酸基團(tuán)。鐵原子到5個(gè)氮原子的距離，包括His 25的Nε原子，相對(duì)于血紅素-HO-配合物中觀察到的氮原子的距離增加。保留了包括Asp140在內(nèi)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)該結(jié)構(gòu)與膽綠蛋白血紅素-血紅素加氧酶(verdoheme-HO)結(jié)構(gòu)相比較時(shí)，血紅素遠(yuǎn)端的構(gòu)象發(fā)生了明顯的改變。F-螺旋位的氫鍵方案由π-螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪龢?gòu)象，而G_(139)羰基氫鍵伙伴由G_(144)酰胺基改變?yōu)镚_(143)。這種微妙的變化導(dǎo)致F-螺旋的方向改變，血紅素口袋變寬。因此，F(xiàn)e3+原子和BV可以從HO中釋放出來，F(xiàn)e3+原子被還原。

6 抑制HO活性的化合物

包括金屬卟啉抑制劑在內(nèi)的幾種HO抑制劑。在這些HO抑制劑中，合成了咪唑-二惡烷類化合物作為哺乳動(dòng)物HOs的抑制劑。這類抑制劑的特點(diǎn)是在誘導(dǎo)性HO-1和組成性Ho-2酶之間具有選擇性。大量的抑制劑分子占據(jù)了狹窄的遠(yuǎn)端口袋，導(dǎo)致遠(yuǎn)端F-螺旋的開放構(gòu)象和遠(yuǎn)端氫鍵網(wǎng)絡(luò)的替換。血紅素丙酸基團(tuán)的構(gòu)象變化與CO引起的構(gòu)象變化相似。生物化學(xué)表征顯示，在咪唑二氧戊環(huán)化合物(DIOCPI)與抑制劑結(jié)合的血紅素與氧的反應(yīng)性相比，形成二氫萘后，HO-1和HO-2的催化反應(yīng)完全停止。這一結(jié)果主要是由于抑制劑結(jié)合的釩與氧的反應(yīng)性較低所致。DIOCPI的4-氯苯基占據(jù)了由苯丙氨酸和蛋氨酸殘基的側(cè)鏈組成的疏水腔，其中CO被瞬間捕獲。DIOCPI占據(jù)血紅素鐵的遠(yuǎn)端，從而抑制血紅素-HO向O2的轉(zhuǎn)化。然而，生化研究表明，DIOCPI嚴(yán)重抑制了膽綠蛋白血紅素向膽綠素-鐵螯合物的轉(zhuǎn)化[18]。合成了多種化合物來選擇性地抑制HO-1和HO-2，通過對(duì)相關(guān)咪唑-二惡烷類化合物與人類HO-1結(jié)合方式的研究發(fā)現(xiàn)，所有這些化合物都以類似的方式與HO-1結(jié)合[19]。雖然對(duì)具有高選擇性的抑制劑進(jìn)行了廣泛的研究，但這些化合物對(duì)HO-1和HO-2選擇性的結(jié)構(gòu)機(jī)制仍不確定。

據(jù)報(bào)道，替代化合物在血紅素的遠(yuǎn)端結(jié)合，這些化合物通過破壞氫鍵網(wǎng)絡(luò)而抑制HO的活性[20]。DL-二硫蘇糖醇(DTT)和二硫代赤蘚醇(DTE)具有較高的親和力。DTE對(duì)HO -1的選擇性比HO-2較高，測(cè)定了DTT-和DTE結(jié)合的大鼠血紅素-HO-1和血紅素-HmuO(HmuO基因是白喉棒狀桿菌利用血紅素和血紅蛋白作為鐵源所必需的；HmuO的產(chǎn)物與真核生物血紅素加氧酶具有同源性，后者參與血紅素的降解和鐵的釋放)的晶體結(jié)構(gòu)。DTT與巰基末端的血紅素鐵結(jié)合，兩個(gè)羥基與環(huán)境氨基酸相互作用。在DTT-血紅素-HO-1和DTE-血紅素-HmuO配合物中，DTT和/或DTE占據(jù)血紅素的遠(yuǎn)端，且缺乏HO反應(yīng)所必需的氫鍵網(wǎng)絡(luò)[1]。

7 哺乳動(dòng)物的BVR特性

HO產(chǎn)生的BV被BVR進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為膽紅素。從大鼠肝、豬脾和人肝中分離純化BVRs。據(jù)報(bào)道，BVR以兩種異構(gòu)體的形式存在，即BVR-A和BVR-B。BVR-A是成人肝臟中主要的BVR形式，催化α-位血紅素裂解產(chǎn)物BV(Ⅸα)還原成BR(Ⅸα)。BV(Ⅸβ)是另一種位于β位置的血紅素裂解產(chǎn)物，被BVR-B還原形成B(Ⅸβ)。在成人中，BV異構(gòu)體的比例為95%～97%Ⅸα和3%～5%Ⅸβ。

8 BVR的晶體結(jié)構(gòu)

在20年代初對(duì)大鼠BVR進(jìn)行了晶體化和晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定[21]。BVR由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即N-末端二核苷酸結(jié)合域和C-末端結(jié)構(gòu)域。N端二核苷酸結(jié)合域由一個(gè)α/β二核苷酸結(jié)合基序組成，這是一個(gè)典型的羅斯曼折疊，其中一個(gè)平行的β片被6個(gè)α螺旋包圍。C終端領(lǐng)域最顯著的特點(diǎn)是一個(gè)大的、扁平的、六股β片。這張紙的一面主要是極性和帶電殘留物的溶劑，從而形成一個(gè)平面表面在分子的一端。NAD配合物大鼠BVR晶體結(jié)構(gòu)的研究也確定了，NAD+被綁定到N端和C端域之間的縫隙上[22]。在大鼠BVR中，NAD氫原子周圍的殘留物包括Tyr 97、Ser170和Arg 172。將這些殘基突變?yōu)槠渌麣埢粫?huì)導(dǎo)致完全失活[23]。雖然基底BV可能在該位點(diǎn)附近結(jié)合，但確切的BV結(jié)合位點(diǎn)和模式尚不清楚。

9 BVR的新功能

最近的研究已經(jīng)建立了新的功能，其中之一是DNA結(jié)合能力。Maines小組報(bào)告，人類BVR與HO-1啟動(dòng)子區(qū)域(稱為ap-1位點(diǎn))結(jié)合和激活轉(zhuǎn)錄因子-2(ATF-2)啟動(dòng)子，ATF-2是激活cAMP反應(yīng)元件cAMP的轉(zhuǎn)錄因子, 是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族中與特定序列相結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白。在調(diào)控正常細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷應(yīng)答中發(fā)揮作用。ATF-2需形成同二聚體或與其他bZIP蛋白如c-Jun形成異二聚體而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。ATF-2具有致癌與抑癌雙重功能[24]。這些啟動(dòng)子區(qū)域具有相似的序列(TGTAGTCA)。因此，通過調(diào)節(jié)HO-1和ATF-2的表達(dá)，使人的BVR在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用是可行的。

BVR的另一個(gè)未被發(fā)現(xiàn)的特點(diǎn)是它作為絲氨酸/蘇氨酸激酶的功能。氧自由基促進(jìn)BVR激酶活性，該酶在cGMP和氧化應(yīng)激作用下的活性與BVR易位到細(xì)胞核中同時(shí)存在[25]。BVR的氨基酸序列包含一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZip)樣的基序，bZip是一種轉(zhuǎn)錄因子，它通常存在于受細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)的激活劑中，對(duì)基因表達(dá)與調(diào)控起重要作用[26]。

綜上所述，這些觀察證實(shí)BVR是一種多功能酶。然而，BV還原、DNA結(jié)合和激酶活性等功能的分子機(jī)制尚不清楚。需要進(jìn)一步的研究才能確定BVR的確切生理作用。