QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS法在糧谷有機(jī)污染物檢測(cè)中的研究進(jìn)展

蔣林惠，周易枚，陳 煜，袁琛凱，陳 彬

南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心 (南通 226000)

農(nóng)藥殘留和真菌毒素是可能污染糧谷的兩類有害物質(zhì)。近年來糧食衛(wèi)生檢查、食品監(jiān)督抽查、食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)等項(xiàng)目中，農(nóng)藥殘留和真菌毒素已經(jīng)成為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象。但由于農(nóng)藥殘留和真菌毒素的品種極多，使檢驗(yàn)工作量嚴(yán)重增加，尤其對(duì)大批量樣品檢查，檢驗(yàn)效率明顯降低。故而開發(fā)高通量的多重污染檢測(cè)技術(shù)變得十分重要。

使用化學(xué)農(nóng)藥，雖在控制農(nóng)作物病蟲害發(fā)生以及保障糧食、經(jīng)濟(jì)作物持續(xù)穩(wěn)產(chǎn)豐收等方面，做出了突出貢獻(xiàn)[1]，但農(nóng)作物可能由此受到嚴(yán)重污染，再加上工業(yè)三廢對(duì)水體土壤的污染，從而使得對(duì)糧谷的污染殘留監(jiān)控變得尤為重要。而糧谷的儲(chǔ)藏加工過程中，由于空氣潮濕或儲(chǔ)藏不善，易遭受各種霉菌的侵害，霉菌的生長(zhǎng)繁殖會(huì)產(chǎn)生多種有毒代謝產(chǎn)物，進(jìn)而造成各種各樣真菌毒素的污染[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界每年大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染，約有2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，造成的損失高達(dá)數(shù)百億美元。中國(guó)作為糧食作物的主要產(chǎn)國(guó)之一，真菌毒素污染也造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

糧谷中農(nóng)藥殘留物主要采用色譜法，包括氣相色譜法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法及液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)，往往需要較為復(fù)雜的樣品提取和凈化等前處理過程。真菌毒素的檢測(cè)則是大多數(shù)先采用免疫親和層析提取、凈化后，再采用高效液相色譜法紫外、熒光檢測(cè)或質(zhì)譜檢測(cè)[4]。這些檢測(cè)方案所需的時(shí)間成本和試劑成本較高，操作繁瑣。隨著檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，多種快速前處理方案的發(fā)布幫助有機(jī)污染物的檢測(cè)往便捷、高效的方向發(fā)展，QuEChERS快速樣品前處理技術(shù)(QuEChERS：Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是近年來發(fā)展較快、應(yīng)用較多的技術(shù)之一。先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)不僅能提高工作效率，節(jié)約資源，也是最終能為食品安全保駕護(hù)航[5]。

本文介紹QuEChERS結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用法近年來在糧谷有機(jī)污染物檢測(cè)中的應(yīng)用，對(duì)其在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)的問題進(jìn)行了分析歸類，提出進(jìn)行方法優(yōu)化的思路，并展望其在糧谷有機(jī)污染物檢測(cè)中的應(yīng)用和發(fā)展。

1 QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

糧食作物生長(zhǎng)過程中易遭受各種病害、蟲害和草害，為提高農(nóng)作物產(chǎn)量，保證糧食生產(chǎn)安全，需要在不同的生長(zhǎng)階段噴施農(nóng)藥。但若農(nóng)藥使用不當(dāng)則會(huì)導(dǎo)致成品糧中農(nóng)藥殘留過多，危害糧谷的食用安全。為快速了解糧谷中農(nóng)藥殘留的實(shí)際情況，開發(fā)快速、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留提取、凈化與檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。目前，QuEChERS法已在農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用[6]。近年來，新儀器新技術(shù)的協(xié)同發(fā)展，使得QuEChERS法提取食品中農(nóng)藥殘留的回收率不斷提高，同時(shí)提取的農(nóng)藥殘留品種不斷增加，檢測(cè)限和定量限也逐漸降低。

陳溪[7]研究了大米205種農(nóng)殘的快速提取，LC-Q-TRAP/MS測(cè)定方案。實(shí)驗(yàn)取大米粉5 g，加10 mL水[8]，15 mL乙腈(含0.1%乙酸)，6 g MgSO4、1.5 g NaCl，上清液8 mL，1200 mg無水硫酸鎂，400 mg C18和400 mg PSA吸附劑，上清液過0.2 μm濾膜，LC-Q-TRAP/MS測(cè)定。205種農(nóng)藥在添加水平為10 μg/kg時(shí)的平均回收率范圍為62.4%～127.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍1.9%～20.0%；添加水平為50 μg/kg時(shí)，平均回收率范圍為65.9%～120.3%，RSD范圍1.0%～18.4%。檢測(cè)大米中205種農(nóng)藥的定量限均低于10 μg/kg，其中176種農(nóng)藥的定量限為0.5 μg/kg，3種農(nóng)藥的定量限為5 μg/kg，11種農(nóng)藥的定量限為2.5 μg/kg，2種農(nóng)藥的定量限為1.25 μg/kg，13種農(nóng)藥的定量限為10.0 μg/kg，滿足我國(guó)、韓國(guó)、日本、歐盟等國(guó)家大米中農(nóng)藥最大殘留限量(MRLs)的要求。

張利明等[9]進(jìn)行了QuEChERS-LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)，針對(duì)稻谷生產(chǎn)中使用的農(nóng)藥種類，大米樣品5 g大米經(jīng)10 mL乙腈提取，加3 g氯化鈉，氮吹濃縮至2 mL，過濾膜，利用LC-MS/MS的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好，R2>0.996，在5、10、50、200 μg/kg 4個(gè)添加水平下，加標(biāo)回收率為80.1%～109.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～13.5%。盧蘭香等[10]稱取適量試樣(黃瓜10 g、大米5 g、茶葉2 g)，加入10 mL水(大米和茶葉加水，黃瓜不加水)，渦旋混勻，加乙腈20 mL，加入醋酸鈉提取鹽，取上層提取液到15 mL PSA/C18凈化管中。取上清液10 mL，45 ℃氮吹濃縮至近干。用1 mL乙腈-0.1%磷酸水(1∶1，v/v)復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。該方法中吡蟲啉在0.05～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.999)，平均回收率在88.3%～109.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于3.5%。

上述研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行糧谷中農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)，多采用含有有機(jī)酸的乙腈溶液進(jìn)行初次提取，再加入鹽析劑(多為硫酸鎂、氯化鈉或醋酸鈉)以期提高萃取效率，凈化試劑主要為單一組分C18、PSA、無水硫酸鎂或其多組分混合物。色譜柱選擇質(zhì)譜專用C18柱即可，目標(biāo)物進(jìn)行LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式掃描定量[11-12]。該類研究方案均能獲得較為滿意的檢出限、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，其指定濃度范圍的線性關(guān)系良好。本文提及的研究對(duì)于提取液、鹽析劑、凈化劑各持己見，但這其中有幾處關(guān)鍵點(diǎn)需要注意，比如提取液的比例(乙腈、水、有機(jī)酸)、鹽析劑及凈化劑的品種及比例選擇。

2 QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

糧谷類是受真菌毒素污染最嚴(yán)重的食品原料。近年來，由于氣候、耕作制度和栽培措施的顯著變化，導(dǎo)致真菌毒素對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的污染愈發(fā)嚴(yán)重。為了應(yīng)對(duì)真菌毒素污染問題，許多國(guó)家和地區(qū)制定了糧食及其制品中真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外研究者也對(duì)食品中真菌毒素的檢測(cè)方法進(jìn)行了深入的研究，研究目的主要集中在提高樣品通量、縮短檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)限和提高準(zhǔn)確性等[13-14]。

與農(nóng)藥殘留相比，QuEChERS法在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用相對(duì)較少，這是由于受真菌毒素污染最嚴(yán)重的食品主要是谷物和豆類，而谷物和豆類與果蔬的基本組分差異較大。谷物和豆類中水分含量較低，同時(shí)糖類、蛋白質(zhì)和脂類的含量遠(yuǎn)高于果蔬。此外，真菌毒素與谷物、豆類等物料組分的結(jié)合形式和果蔬中農(nóng)藥殘留也有所不同。近年來，許多學(xué)者根據(jù)谷物和豆類的特性開發(fā)了許多基于QuEChERS法的真菌毒素檢測(cè)方法。

陳慧菲等[15]經(jīng)過研究用改良的QuEChERS方法進(jìn)行提取，用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定谷物中的8種真菌毒素。5 g樣品，提取液16 mL 1%的乙酸乙腈，鹽析劑6 g MgSO4、1.5 g NaCl，1 mL甲醇-乙酸銨溶液(1∶1，v/v)復(fù)溶，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。8種毒素的線性相關(guān)系數(shù)(R2)均不小于0.998，檢出限0.3～1.0 μg/kg，加標(biāo)回收率76.5%～113.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.78%～5.03%。姜濤等[16]建立了玉米中共17種真菌毒素的測(cè)定方法，5 g樣品，提取液25 mL含有1%甲酸的乙腈水(80∶20，v/v)，鹽析劑3 g NaCl，上清液濃縮至1 mL，0.1 g C18凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。線性相關(guān)系數(shù)(R2)均不小于0.994，檢出限為0.1～20.0 μg/kg，加標(biāo)回收率為70.76%～115.14%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.21%～11.34%。肖全偉等[17]實(shí)現(xiàn)了小麥中8種真菌毒素的同時(shí)測(cè)定。2 g樣品，8 mL 0.3%甲酸水溶液，10 mL乙腈提取，鹽析劑1.5 g MgSO4、0.5 g NaCl，上清液2 mL，150 mg無水硫酸鎂，150 mg C18和20 mg PSA吸附劑，提取液濃縮后20%乙腈水溶液溶解，液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。8種真菌毒素在小麥中線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99，方法檢出限0.10～1.0 μg/kg，樣品平均加標(biāo)回收率85.1%～95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.8%～8.5%。

王麗娟等[18]進(jìn)行糧谷中16種真菌毒素測(cè)定研究，5 g樣品經(jīng)20 mL乙腈-水-乙酸(84∶15∶1，v/v)溶液超聲提取，鹽析劑4 g無水MgSO4、1 g NaCl，提取液采用120 mg C18、600 mg MgSO4凈化，凈化液過0.22 μm微孔濾膜，用HPLC-MS/MS分析檢測(cè)，結(jié)果能滿足日常檢測(cè)需求。Koesukwiwat等[19]采用研究利用QuEChERS法提取大米中的14種真菌毒素，所用提取溶劑為水-乙腈(10∶10，v/v)混合溶劑，鹽析劑4 g MgSO4和1 g NaCl，8 mL上清液，加入1.2 g MgSO4、0.25 g C18、0.25 g中性氧化鋁(Al-N)和0.4 g PSA凈化，結(jié)果滿意度高。

總結(jié)上述學(xué)者對(duì)于谷物中真菌毒素的檢測(cè)方案：提取液中水的比例是提取效率的關(guān)鍵點(diǎn)，選擇水、乙腈、有機(jī)酸三者的比例對(duì)于提高提取率十分重要；鹽析劑的選擇與農(nóng)藥殘留提取相似；凈化試劑則更為多樣化，C18、PSA、中性氧化鋁、MgSO4；濃縮后復(fù)溶試劑的選擇十分重要(有機(jī)相種類、有機(jī)相比例、銨鹽)，建議選擇與初始流動(dòng)相相一致的復(fù)溶試劑。

3 QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在復(fù)合污染物檢測(cè)中的應(yīng)用

總結(jié)現(xiàn)有的QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于糧谷類產(chǎn)品的實(shí)例，其多局限于農(nóng)藥殘留或真菌毒素單類藥物，使用QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定農(nóng)獸藥殘留和真菌毒素的方法仍較少見。

趙健等[20]建立了同時(shí)測(cè)定大米10種真菌毒素和殺鼠劑的檢測(cè)方法。大米樣品2.5 g，使用10 mL乙腈-水-甲酸(體積比80∶19∶1)作為提取溶液，80 mg PSA凈化，凈化溶液經(jīng)濃縮、復(fù)溶后，采用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：10種藥物的線性范圍為2～100 μg/L，線性關(guān)系良好(R2>0.99)，各藥物的平均加標(biāo)回收率在75.2%～110.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%～10.7%，方法定量限在0.5～2.5 μg/kg，適用于大米中10種殺鼠劑和真菌毒素殘留的同時(shí)快速定性定量分析。高璐斐[4]進(jìn)行了小麥種污染物的專項(xiàng)研究，實(shí)驗(yàn)稱取5 g樣品，加入20 mL甲酸/水/乙腈(v/v/v，1∶14∶85)和少量的氯化鈉以及4 g硫酸鈉，提取上清液5 mL，裝入0.1 g C18吸附劑，取上清液3 mL濃縮，加入500 μL甲醇/水(v/v，3∶2)混合液溶解，過0.22 μm濾膜，液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。采用本方法可以同時(shí)對(duì)14種小麥污染物進(jìn)行定性定量測(cè)定，其線性方程相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99；檢測(cè)低限均在現(xiàn)有限量范圍內(nèi)；農(nóng)藥殘留殘留回收率在87%～103%之間，真菌毒素回收率在82%～96%之間。

同時(shí)提取測(cè)定多類有機(jī)污染物，所需考慮的因素相應(yīng)增加，農(nóng)藥殘留類物質(zhì)與真菌毒素類在有些性質(zhì)方面相差較遠(yuǎn)，如何選擇一個(gè)合適的提取體系變得較為困難。糧谷類的特殊性質(zhì)對(duì)于凈化試劑也有特殊選擇性，需根據(jù)實(shí)際樣品進(jìn)行篩選，凈化試劑多選擇單一品種，不再進(jìn)行多成分組合。

4 結(jié)語

大量的研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行糧谷中農(nóng)藥真菌毒素殘留的高通量快速檢測(cè)技術(shù)研究，從前處理的快速提取技術(shù)到目標(biāo)物的儀器確認(rèn)，其思路一脈相承。QuEChERS技術(shù)講究快速、簡(jiǎn)單、低了價(jià)、高效、安全，其主要通過提取液提取、鹽析劑萃取、凈化試劑再凈化三大步驟進(jìn)行樣品中目標(biāo)物的富集。

各項(xiàng)研究中，提取液、鹽析劑、凈化劑得選擇并不一致，有些研究甚至省略了凈化步驟。這些方法雖然在已有研究中獲得了較為滿意得效果，但作為一種通用方案并不完善。筆者期望能夠?qū)σ延械梅椒ㄟM(jìn)行優(yōu)化，建立一種適用于糧谷中多類別污染物的快速檢測(cè)技術(shù)。進(jìn)行糧谷中農(nóng)藥殘留及真菌毒素的檢測(cè)時(shí)，對(duì)以下幾個(gè)方面提出優(yōu)化建議。

(1)提取液。需特別注意糧谷樣品蛋白質(zhì)及糖類組分較高，提取和凈化過程中易交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提取液中加入一定比例的水，能浸潤(rùn)糧谷顆粒，增加有機(jī)溶劑對(duì)非水溶性基質(zhì)的滲透性，提高目標(biāo)物提取效果；有機(jī)相選擇乙腈，因乙腈易于鹽析、溶解農(nóng)藥、真菌毒素的能力較強(qiáng)，且萃取物中脂類物質(zhì)的雜質(zhì)含量較低；少量的甲酸能調(diào)節(jié)pH，并有效提取對(duì)于酸度、極性較為敏感的真菌毒素，并降低對(duì)堿敏感的農(nóng)藥或毒素的影響[21]。故而建議提取液選擇乙腈∶水∶甲酸的混合溶液。

(2)鹽析劑。MgSO4是促進(jìn)液液分配的最佳選擇，且可以增大極性組分的回收率，但會(huì)引入極性組分雜志；添加NaCl可以調(diào)節(jié)極性、減少極性雜質(zhì)的干擾，但也會(huì)導(dǎo)致液液分配效果變差。在實(shí)際應(yīng)用將MgSO4和NaCl混合使用，以獲得最佳鹽析效果。鹽析劑選擇MgSO4∶NaCl質(zhì)量比為4∶1。

(3)凈化試劑。C18對(duì)長(zhǎng)鏈脂類物質(zhì)、甾醇等非極性干擾物有良好的吸附效果。PSA能有效吸附糖類、脂肪酸、有機(jī)酸、脂類以及某些色素等，也易與酸性真菌毒素(OTA等)分子上羧基反應(yīng)，影其回收率。凈化試劑建議選擇C18。

(4)復(fù)溶試劑。復(fù)溶試劑的選擇需兼顧目標(biāo)物的溶解能力及溶劑效應(yīng)。建議選擇初始流動(dòng)相作為目標(biāo)物的復(fù)溶試劑。

建立適用于糧谷中真菌毒素及農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方案，達(dá)到高效，準(zhǔn)確，高通量的目標(biāo)，除上述關(guān)鍵點(diǎn)，可能還有其它方面，需要通過更深入的探索來加以完善。