牛源性大腸桿菌O26熱休克-酸應(yīng)激響應(yīng)

宓曉雨，張 蘇，王思亓，趙王晨，禹金龍，林思棋，王龍鳳，江 蕓

（南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210023）

大腸桿菌O157:H7是重要的食源性致病菌，然而近年來非O157大腸桿菌，尤其是“Big six”血清型（O26、O45、O103、O121、O111、O145）所引發(fā)的食品安全事件越來越受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注，其中O26是威脅人類健康的最重要的非O157大腸桿菌，居“Big six”之首[1-3]。反芻動物，尤其是牛，是致病大腸桿菌的主要宿主。本課題組前期從牛糞、牛肉中對非O157大腸桿菌進(jìn)行了分離鑒定，也發(fā)現(xiàn)O26是最主要的血清型[4]。與大腸桿菌O157:H7相似，O26也可導(dǎo)致人體腹瀉，以及出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥等嚴(yán)重并發(fā)癥[1,5]。

食品加工貯藏過程中各種措施可對腐敗菌和致病菌產(chǎn)生應(yīng)激脅迫，導(dǎo)致有害菌損傷或死亡，有效延長貨架期。一般認(rèn)為多種措施聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可發(fā)揮柵欄效應(yīng)，增強(qiáng)抑菌效果[6-7]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在多重應(yīng)激條件下有可能產(chǎn)生交叉保護(hù)現(xiàn)象，增強(qiáng)有害菌的抗性，從而提高存活能力，加大食品安全的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。酸化是食品加工中常見措施，其中酸性洗液或發(fā)酵食品中存在的乳酸可有效抑制有害菌的生長繁殖。加熱也是食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。早期有研究發(fā)現(xiàn)，熱休克處理可增強(qiáng)大腸桿菌O157:H7的耐酸能力，提高存活率[10-11]。目前，熱休克-酸應(yīng)激對非O157大腸桿菌的存活，尤其是對應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以前期分離的牛源性大腸桿菌O26為研究對象[4]，首先比較22 株牛源性O(shè)26酸耐受能力，再選取代表菌株研究熱休克-酸應(yīng)激對其存活及應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響。旨在為非O157大腸桿菌的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估提供理論基礎(chǔ)，為實(shí)際生產(chǎn)加工中非O157大腸桿菌的有效控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

22 株大腸桿菌O26，由本實(shí)驗(yàn)室前期分離自牛糞和牛肉，其中攜帶毒力基因的有3 株，包括G13Z1（stx1+、hly+）、G10Z1（hly+）、133Z（hly+）。

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、酵母浸粉（yeast extract，YE） 北京陸橋公司；乳酸、鹽酸、pH值校正緩沖溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 南京化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒 大連寶生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

IS128C pH計(jì) 上海儀邁儀器科技有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技公司；SG403A生物安全柜 美國Baker公司；7500 real-time PCR儀美國Applied Biosystems公司；Nanodrop-2000核酸蛋白分析儀 美國Thermo公司；2-16KL高速冷凍離心機(jī)美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

將22 株O26凍存菌液分別經(jīng)TSA劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落分別接種于3 mL TSB中，220 r/min、37 ℃ 振蕩培養(yǎng)18 h，再轉(zhuǎn)接至100 mL TSB中，220 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，約至9（lg（CFU/mL））。

1.3.2 酸耐受實(shí)驗(yàn)

吸取1.3.1節(jié)菌液10 mL，8 000×g、4 ℃離心10 min，沉淀用PBS（pH 7.2）洗滌2 次，分別重懸于等體積的鹽酸酸化TSB（pH 2.0）、乳酸酸化TSB（pH 3.5）中，37 ℃應(yīng)激處理2 h，離心，沉淀用PBS洗滌重懸終止應(yīng)激反應(yīng)。TSA-YE平板37 ℃培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)。進(jìn)一步計(jì)算應(yīng)激后相對于應(yīng)激前菌數(shù)的存活率。

1.3.3 熱休克-酸應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

根據(jù)乳酸耐受情況，選取代表菌株混合菌液進(jìn)行熱休克-酸應(yīng)激存活實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步根據(jù)存活情況，選取代表菌株進(jìn)行應(yīng)激基因表達(dá)分析。

1.3.3.1 應(yīng)激處理

熱休克處理：將1.3.1節(jié)代表菌株的菌液等量混合，吸取10 mL，8 000×g、4 ℃離心10 min，沉淀用PBS（pH 7.2）洗滌2 次，重懸于10 mL TSB中，48 ℃水浴15 min，冰水浴3 min終止[12-14]。

分別取熱休克菌液和未熱休克菌液0.1 mL接種于乳酸酸化的9.9 mL TSB（pH 3.5），37 ℃應(yīng)激處理2、4、6、8 h，前者為熱休克-酸應(yīng)激組，后者為酸應(yīng)激組。同時(shí)未熱休克菌液0.1 mL接種于9.9 mL正常TSB作為對照組。TSA-YE培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.3.3.2 應(yīng)激基因表達(dá)分析

應(yīng)激處理2、4 h樣品，離心、PBS洗滌重懸、再離心，菌體沉淀按試劑盒說明書提取總RNA，進(jìn)一步檢測總RNA的濃度和純度，當(dāng)A260nm/A280nm在1.8～2.0時(shí)表明純度較好。

cDNA合成：首先用RNase-free DNase I去除基因組DNA以保證反轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，其中PrimeScrept RT Master Mix 6 μL，total RNA終質(zhì)量濃度50 ng/μL，RNase Free dH2O補(bǔ)足體積。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min；85 ℃反轉(zhuǎn)錄失活反應(yīng)5 s；4 ℃，∞。cDNA于-20 ℃凍存。

real-time PCR：引物序列如表1所示[15-19]，用于擴(kuò)增大腸桿菌O26的一般應(yīng)激基因rpoS、酸應(yīng)激相關(guān)基因（asr、ycfR、gadA）及熱應(yīng)激相關(guān)基因（rpoH、dnaK、clpB、groEL），內(nèi)參基因?yàn)閞rsA[15]。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）為SYBR Premix ExTaq（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，上下游引物各0.4 μL，RNase Free水補(bǔ)足。PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s（40 個循環(huán)）；60～95 ℃，熔點(diǎn)分析。

表1 應(yīng)激相關(guān)基因real-time PCR引物Table 1 Real-time PCR primer sequences for stress response genes

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌O26菌株酸耐受比較

鹽酸耐受實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸處理2 h后22 株菌存活菌數(shù)均顯著下降（P＜0.05），但耐受情況存在菌株差異，其中菌株133Z（hly+）存活率最高（92.92%），而菌株G13Z1（stx1+、hly+）下降最明顯，存活率為57.98%（圖1A）。乳酸耐受實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳酸處理2 h后22 株菌存活菌數(shù)均顯著下降（P＜0.05），耐受情況亦存在菌株差異，菌株43SZ、77Z2、1Z2、G13Z1（stx1+、hly+）乳酸耐受較強(qiáng)，存活率達(dá)84%以上，其中菌株43SZ存活率最高（91.08%）；菌株G10Z1（hly+）（65.46%）、83Z2（63.43%）、83Z3（62.54%）存活率較低（圖1B）。

圖1 22 株大腸桿菌O26鹽酸（A）和乳酸（B）耐受結(jié)果Fig.1 Hydrochloric acid (A) and lactic acid (B) tolerance of 22 E.coli O26 isolates

綜合兩種酸的耐受情況，22 株菌對鹽酸和乳酸的耐受存在不同，菌株43SZ、123Z1對鹽酸和乳酸均較耐受，G13Z1（stx1+、hly+）不耐鹽酸，對乳酸則有較高耐受能力，而G10Z1（hly+）不耐乳酸，對鹽酸則有較高耐受能力。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3 株毒力基因陽性的O26菌株G13Z1（stx1+、hly+）、G10Z1（hly+）、133Z（hly+）并沒有呈現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受能力。

2.2 熱休克-酸應(yīng)激對大腸桿菌O26存活的影響

根據(jù)酸耐受情況，選取以下5 株菌進(jìn)行熱休克-乳酸應(yīng)激：43SZ（鹽酸和乳酸耐受力均較強(qiáng)）、G13Z1（鹽酸耐受力最弱、乳酸耐受力較強(qiáng)）、49Z3（鹽酸耐受力較弱、乳酸耐受力中等）、G10Z1（鹽酸耐受力較強(qiáng)、乳酸耐受力較弱）、83Z3（鹽酸耐受力中等、乳酸耐受力較弱）。如圖2所示，混菌初始菌數(shù)約7.0（lg（CFU/mL）），在對照組中菌數(shù)逐漸增加，8 h后達(dá)到9.0（lg（CFU/mL））以上。酸應(yīng)激組，應(yīng)激2 h存活菌數(shù)即顯著下降（P＜0.05），隨著應(yīng)激時(shí)間的延長存活菌數(shù)繼續(xù)下降，至8 h時(shí)已檢測不出。熱休克-酸應(yīng)激組，應(yīng)激后存活菌數(shù)亦逐漸下降，但應(yīng)激4 h及以后存活菌數(shù)均顯著高于酸應(yīng)激組（P＜0.05），表明熱休克處理提高了酸應(yīng)激菌體的存活。

圖2 大腸桿菌O26熱休克-酸應(yīng)激存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Survival of E.coli O26 under heat shock-acid stress

2.3 熱休克-酸應(yīng)激對大腸桿菌O26應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

選取菌株G10Z1（hly+，分離自牛肉）進(jìn)一步分析熱休克-酸應(yīng)激2、4 h時(shí)其應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)差異。rpoS基因表達(dá)情況與對照組相比，酸應(yīng)激2、4 h均顯著下調(diào)（P＜0.05）、熱休克-酸應(yīng)激組均顯著上調(diào)（P＜0.05）；與酸應(yīng)激組相比，熱休克-酸應(yīng)激組均顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖3）。

圖3 熱休克-酸應(yīng)激時(shí)大腸桿菌O26 rpoS基因表達(dá)Fig.3 Expression of rpoS in E.coli O26 under heat shock-acid stress

酸應(yīng)激相關(guān)基因asr、ycfR、gadA表達(dá)情況見圖4。其中asr基因酸應(yīng)激2、4 h均顯著下調(diào)，熱休克-酸應(yīng)激組與酸應(yīng)激組相比顯著上調(diào)（P＜0.05）。ycfR基因酸應(yīng)激2 h顯著下調(diào)，4 h顯著上調(diào)，而熱休克-酸應(yīng)激組2、4 h均顯著上調(diào)。gadA基因應(yīng)激后均顯著下調(diào)（P＜0.05），且熱休克-酸應(yīng)激組下調(diào)更明顯。

圖4 熱休克-酸應(yīng)激時(shí)大腸桿菌O26酸應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)Fig.4 Expression of acid stress response genes in E.coli O26 under heat shock-acid stress

熱應(yīng)激相關(guān)基因rpoH、clpB、dnaK、groEL表達(dá)見圖5。酸應(yīng)激2、4 h，4 種基因均顯著下調(diào)；熱休克-酸應(yīng)激組4 種基因除clpB、groEL2 h下調(diào)，其他均顯著上調(diào)（P＜0.05）。

圖5 熱休克-酸應(yīng)激時(shí)大腸桿菌O26熱應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)Fig.5 Expression of heat stress response genes in E.coli O26 under heat shock-acid stress

綜上，與對照組相比，菌株O26酸應(yīng)激2、4 h基因表達(dá)水平顯著下調(diào)（除ycfR4 h組）；與酸應(yīng)激組相比，熱休克-酸應(yīng)激2、4 h基因表達(dá)水平顯著上調(diào)（除gadA基因）。

3 討 論

乳酸在食品生產(chǎn)加工中廣泛存在，對食源性致病菌具有良好的抑制和殺滅效應(yīng)[21]。由于菌株差異，其應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制的不同，導(dǎo)致對乳酸應(yīng)激呈現(xiàn)不同的應(yīng)激存活反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)對22 株牛源性大腸桿菌O26進(jìn)行耐酸性比較，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O26對乳酸耐受存在明顯菌株差異。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)同一菌株對乳酸、鹽酸的耐受性不同，這與細(xì)菌對有機(jī)酸和無機(jī)酸的應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制不同有關(guān)[22-23]。

食品生產(chǎn)加工中柵欄技術(shù)的使用，不同柵欄因子聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮協(xié)同殺菌效應(yīng)，顯著增強(qiáng)抑菌效果[6-7]；另一方面，交叉保護(hù)效應(yīng)的存在[8-9]也越來越引起研究者的重視。加熱是重要的生產(chǎn)加工手段，可有效控制有害菌，而加熱不充分、溫?zé)崽幚硪灿锌赡芴岣邿嵝菘司w對致死性應(yīng)激的耐受能力，產(chǎn)生交叉保護(hù)。Wiegand等[10]發(fā)現(xiàn)熱休克處理（48.3 ℃或49.4 ℃，5 min）提高了碎牛肉中大腸桿菌O157:H7經(jīng)54.4 ℃處理后的存活菌數(shù)。熱休克處理（47 ℃，15 min）提高了阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）對低溫和冷凍、干燥、高滲透、酸、乙醇、抗感染劑等多種應(yīng)激的耐受[12,24]。Tetteh等[13]發(fā)現(xiàn)熱休克處理（48 ℃，15 min）增強(qiáng)了福氏志賀菌（Shigella flexneri）對醋酸、乳酸、丙酸的耐受能力。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)熱休克處理（48 ℃，10 min）增強(qiáng)了大腸桿菌O157:H7對鹽酸的耐受能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱休克處理（48 ℃，15 min）增強(qiáng)了大腸桿菌O26的乳酸耐受能力，存活菌數(shù)顯著提高，表明熱休克對酸應(yīng)激菌體產(chǎn)生了交叉保護(hù)，這將增加食品安全風(fēng)險(xiǎn)，需引起重視。

應(yīng)激過程中相關(guān)基因參與細(xì)菌的應(yīng)激響應(yīng)。大腸桿菌于非致死性酸性條件下可誘導(dǎo)多種耐酸系統(tǒng)和相關(guān)基因表達(dá)[25]。rpoS基因是調(diào)節(jié)一般應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，可保護(hù)細(xì)菌免受有害環(huán)境條件的傷害[26]。Lee等[27]研究報(bào)道酸性條件（pH 4.4）誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌rpoS蛋白表達(dá)上調(diào)。然而，Yang Yishan等[28]研究發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌長期暴露于乳酸條件并未上調(diào)rpoS表達(dá)，King等[29]也發(fā)現(xiàn)大腸桿菌酸性pH值時(shí)rpoS水平較中性pH值低，本實(shí)驗(yàn)乳酸（pH 3.0）應(yīng)激后大腸桿菌O26rpoS基因表達(dá)也下調(diào)。上述報(bào)道不完全一致的原因可能與菌種、菌株、酸濃度、應(yīng)激時(shí)間等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中熱休克-酸應(yīng)激O26菌株rpoS基因表達(dá)上調(diào)，表明熱休克產(chǎn)生的交叉保護(hù)與rpoS基因的表達(dá)有關(guān)。

asr基因在酸應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[17]。谷氨酸依賴型耐酸系統(tǒng)是大腸桿菌最有效的耐酸系統(tǒng)，gadA、gadB、gadC是主要的關(guān)鍵基因[25]。本實(shí)驗(yàn)乳酸應(yīng)激后酸應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)基本下調(diào)，可能是該酸性條件對菌株G10Z1來說應(yīng)激程度強(qiáng)烈，達(dá)到致死性水平。進(jìn)一步熱休克處理導(dǎo)致上述基因表達(dá)上調(diào)，表明熱休克的交叉保護(hù)與這些酸應(yīng)激基因的表達(dá)有關(guān)。Carruthers等[30]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7熱休克處理（50 ℃，15 min）導(dǎo)致82 個基因上調(diào)，包括rpoH、dnaK、groEL等。本實(shí)驗(yàn)乳酸應(yīng)激后O26的rpoH、dnaK、groEL、clpB基因表達(dá)均顯著下調(diào)，但熱休克-酸應(yīng)激處理基本上調(diào)，表明熱休克的交叉保護(hù)與這些熱應(yīng)激基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選取牛源性O(shè)26菌株乳酸耐受性能不同的菌株混合進(jìn)行熱休克-酸應(yīng)激存活實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)O26酸耐受程度呈現(xiàn)菌株差異，且同一菌株對乳酸、鹽酸的耐受情況有差異。熱休克-酸應(yīng)激存活實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激導(dǎo)致存活菌數(shù)顯著下降，而熱休克可發(fā)揮交叉保護(hù)效應(yīng)，增強(qiáng)了O26抗酸能力。酸應(yīng)激導(dǎo)致應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)基本下調(diào)，而熱休克-酸應(yīng)激與酸應(yīng)激菌體相比上述基因表達(dá)基本上調(diào)，表明熱休克可能通過增加應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮交叉保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，當(dāng)非致死性熱處理與酸化聯(lián)合使用時(shí)應(yīng)注意交叉保護(hù)可能導(dǎo)致的O26食品風(fēng)險(xiǎn)增加的現(xiàn)象。在食品實(shí)際生產(chǎn)加工中，當(dāng)多種措施聯(lián)合應(yīng)用時(shí)食源性致病菌的風(fēng)險(xiǎn)評估及如何科學(xué)有效控制值得加強(qiáng)重視。