白山毛桃根提取物通過調(diào)控miR-182-5p/PCDH10表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲

胡玉海 王晨 謝宇端 余婷 汪浩

(1武漢市漢口醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430012；2中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院檢驗科；3武漢市精神衛(wèi)生中心檢驗科)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌亞型，是全球癌癥相關(guān)死亡的重要原因〔1〕。目前，包括手術(shù)、化療、放療等治療方式存在不足之處，亟待開發(fā)新的NSCLC治療策略〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)中藥輔助治療能改善NSCLC患者生活質(zhì)量，降低不良反應(yīng)，對提高其遠(yuǎn)期生存具有一定優(yōu)勢〔3，4〕。白山毛桃根是民間傳統(tǒng)中藥，其在胃癌、鼻咽癌、乳腺癌已被證實具有抗腫瘤活性〔5，6〕。白山毛桃根提取物對黑色素瘤細(xì)胞異常遷移和侵襲、白血病細(xì)胞增殖具有抑制作用〔7〕。本實驗探索了白山毛桃根提取物對NSCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并分析其抗腫瘤作用與miR-182-5p/原鈣黏蛋白細(xì)胞黏附分子(PCDH10)軸的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1材料與試劑 人NSCLC細(xì)胞株H1299購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RT-qPCR試劑盒(日本Takara公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)(美國R&D Systems)；蛋白提取試劑盒(碧云天生物公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1白山毛桃根提取物溶液的配制 參考王水英〔7〕實驗方法制備白山毛桃根提取物，準(zhǔn)確稱量50 g白山毛桃根，浸泡1 h后加熱煮沸1 h，然后過濾收集殘渣，再進(jìn)行二次煮沸、過濾。合并兩次濾液，過濾、除菌保存。

1.2.2細(xì)胞處理與分組 H1299細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，分別用10、20、40、60 μg/ml的白山毛桃根提取物處理H1299細(xì)胞，作為不同濃度白山毛桃根提取物組，不作任何處理的作為對照組；將miR-182-5p抑制劑及其陰性對照轉(zhuǎn)染至H1299中，記為anti-miR-182-5p組、anti-miR-NC組；將miR-182-5p、miR-NC轉(zhuǎn)染至H1299后用40 μg/ml白山毛桃根提取物處理，記為白山毛桃根提取物+miR-182-5p組、白山毛桃根提取物+miR-NC組。

1.2.3RT-qPCR檢測miR-182-5p和PCDH10 mRNA表達(dá) 提取H1299細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后參照熒光定量說明進(jìn)行PCR擴增；miR-182-5p和PCDH10 mRNA的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt公式計算。

1.2.4Western印跡檢測PCDH10蛋白表達(dá) 提取H1299細(xì)胞的蛋白，煮沸變性后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕式轉(zhuǎn)膜裝置轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗4℃孵育膜過夜，二抗室溫孵育膜2 h。顯影、定影，分析PCDH10蛋白條帶相對灰度值。

1.2.5MTT法測定NSCLC H1299細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明加入MTT和DMSO試劑，酶標(biāo)儀檢測490 nm處OD值，計算細(xì)胞抑制率(%)。

1.2.6Transwell法檢測H1299細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù) 收集anti-miR-NC組、anti-miR-182-5p組、白山毛桃根提取物+miR-NC組、白山毛桃根提取物+miR-182-5p組H1299細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)，接種于Transwell 小室上層，培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)液，清洗細(xì)胞，風(fēng)干Transwell小室后，用結(jié)晶紫染色，顯鏡下計數(shù)。侵襲實驗時選擇包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其余步驟同遷移實驗。

1.2.7熒光素酶報告基因?qū)嶒?構(gòu)建PCDH10的野生型和突變型熒光素酶報告載體(WT-PCDH10和MUT-PCDH10)，將其分別與miR-182-5p和miR-NC轉(zhuǎn)染到H1299細(xì)胞，使用試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，白山毛桃根提取物(10、20、40、60 mg/ml)組H1299細(xì)胞24 h、48 h、72 h時的抑制率顯著升高，且具有濃度依賴性(P<0.05)，見表1。后續(xù)選擇40 mg/ml的白山毛桃根提取物作用48 h(抑制率約50%)進(jìn)行實驗。

表1 白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞增殖的影響

2.2白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞遷移、侵襲的影響 白山毛桃根提取物組H1299細(xì)胞遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量顯著低于對照組(均P<0.001)，見表2。

表2 白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞遷移、侵襲的影響個)

2.3白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞中miR-182-5p和PCDH10表達(dá)的影響 白山毛桃根提取物組H1299細(xì)胞中PCDH10 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)，而miR-182-5p表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)，見圖1，表3。

表3 白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞中miR-182-5p和PCDH10表達(dá)的影響

圖1 白山毛桃根提取物對PCDH10蛋白表達(dá)的影響

2.4miR-182-5p靶向調(diào)控PCDH10的表達(dá) TargetScan預(yù)測顯示PCDH10的3′UTR與miR-182-5p有結(jié)合位點(圖2)。miR-182-5p和WT-PCDH10共轉(zhuǎn)染顯著降低細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.001)；而miR-182-5p和MUT-PCDH10共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。過表達(dá)miR-182-5p可降低PCDH10蛋白表達(dá)(miR-NC組：0.42±0.03、miR-182-5p組：0.17±0.03，P<0.05)；抑制miR-182-5p表達(dá)可提高PCDH10蛋白的表達(dá)(anti-miR-NC組：0.37±0.04，anti-miR-182-5p組：0.72±0.07，P<0.05)，見圖3。

圖2 PCDH10與miR-182-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組、miR-182-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-182-5p組圖3 miR-182-5p調(diào)控PCDH10蛋白表達(dá)

2.5抑制miR-182-5p表達(dá)對H1299細(xì)胞遷移、侵襲的影響 anti-miR-182-5p組H1299細(xì)胞miR-182-5p表達(dá)水平明顯低于anti-miR-NC組，遷移和侵襲數(shù)量顯著低于anti-miR-NC組(均P<0.001)，見表5。

表5 抑制miR-182-5p表達(dá)對H1299細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.6miR-182-5p過表達(dá)減弱了白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 與白山毛桃根提取物+miR-NC組相比，白山毛桃根提取物+anti-miR-182-5p組miR-182-5p表達(dá)水平升高，PCDH10蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞抑制率降低，H1299細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量升高(P<0.05)，見圖4，表6。

1～4：對照組、白山毛桃根提取物組、白山毛桃根提取物+miR-NC組、白山毛桃根提取物+miR-182-5p組圖4 Western印跡檢測PCDH10蛋白表達(dá)

表6 過表達(dá)miR-182-5p減弱了了白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

3 討 論

NSCLC是全球范圍內(nèi)死亡率和發(fā)病率最高的惡性腫瘤，已給人類身體健康和生命安全造成巨大威脅〔8〕。中醫(yī)藥治療主要是從消除患者體內(nèi)腫瘤生長的條件環(huán)境，促進(jìn)免疫，防止腫瘤的轉(zhuǎn)移等來實現(xiàn)抗腫瘤的作用；能夠提高患者的生存質(zhì)量，延長生存期〔9〕。白山毛桃根具有抗腫瘤、抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用〔10〕。林水花等〔11〕研究表明相較于地上部分，毛花獼猴桃的根對胃癌、鼻癌、乳腺癌有抑制作用。毛花獼猴桃根提取物對體外腫瘤細(xì)胞有抑制作用，還可以增強小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬作用〔12〕。毛花獼猴桃根提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)白山毛桃根提取物能抑制胃癌〔14〕、人紅白血病K562細(xì)胞〔15〕、黑色素瘤M21細(xì)胞〔16〕的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。毛花獼猴桃中提取出的多糖能抑制小鼠移植性S180肉瘤的生長，促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，增強自然殺傷細(xì)胞活性〔17〕；還能提高細(xì)胞免疫能力〔18〕。

miR-182已被報道在肺癌〔19〕、結(jié)腸癌〔20〕、胃癌〔21〕等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)與未接受治療NSCLC患者相比，接受中西醫(yī)聯(lián)合治療且療效獲益的晚期NSCLC患者miR-182-5p表達(dá)顯著降低〔22〕。miR-182高表達(dá)與NSCLC細(xì)胞浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)〔23〕。miR-182通過下調(diào)靶基因RECK、PFN1表達(dá)可誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔24，25〕。此外，下調(diào)miR-182-5p表達(dá)還可提高NSCLC細(xì)胞對順鉑的敏感性〔26〕。

PCDH10是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因〔27〕，其在多種腫瘤中下調(diào)表達(dá)或缺失，影響腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為〔28〕。研究表明PCDH10甲基化狀態(tài)可用于評估病理Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌根治性切除術(shù)的預(yù)后〔29〕。PCDH10啟動子甲基化誘導(dǎo)的PCDH10表達(dá)下調(diào)或缺失還可促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展〔30〕。胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌中PCDH10表達(dá)下降，恢復(fù)PCDH10表達(dá)明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔31～33〕。此外，PCDH10對子宮內(nèi)膜腺樣癌進(jìn)展亦具有抑制作用〔34〕。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛參與中藥抗腫瘤的作用過程，中藥作用后通過上調(diào)或下調(diào)miRNA的表達(dá)，促進(jìn)其靶基因降解或抑制其靶基因的翻譯來發(fā)揮中藥抗腫瘤的作用〔35〕。清熱燥濕類中藥通過調(diào)節(jié)miR-124的表達(dá)治療濕疹炎癥〔36〕。丹皮酚通過上調(diào)miR-19b的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控miR-19b靶基因TNFRSF12A抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡〔37〕。姜黃素可以降低miR-21的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而提高miRNA-21靶基因PDCD4的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡〔38〕。白藜蘆醇下調(diào)miR-151表達(dá)可抑制肝癌發(fā)生〔39〕。miRNA調(diào)控機制為中醫(yī)藥治療癌癥提供了新的視角、研究思路和理論依據(jù)〔40〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度白山毛桃根提取物處理后H1299細(xì)胞的抑制率顯著升高，遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量低；且白山毛桃根提取物降低了miR-182-5p的表達(dá)水平，提高了PCDH10的表達(dá)水平；且miR-182-5p可靶向調(diào)控PCDH10 的表達(dá)，抑制miR-182-5p表達(dá)后H1299細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量降低，而miR-182-5p過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)白山毛桃根提取物對H1299細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。

總之，白山毛桃根提取物可能通過調(diào)控miR-182-5p/PCDH10抑制NSCLC細(xì)胞H1299增殖、遷移和侵襲。