冰鮮雞預(yù)冷過程中微生物菌群多樣性動態(tài)分析

王 倩，唐敏敏，孫芝蘭 ，劉 芳，徐為民, ，王道營，李金平，馬晶晶

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院, 江蘇南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 江蘇南京 210014；3.徐州鑫科食品有限公司, 江蘇徐州 221637）

冰鮮雞是指活雞被宰殺后，胴體經(jīng)嚴格的檢疫制度檢驗完成后進行冷卻處理，使得溫度在1 d內(nèi)降至0~4 ℃的范圍內(nèi)，然后包裝并在后續(xù)的一系列過程中使溫度維持在此范圍內(nèi)的鮮雞[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在生產(chǎn)加工過程中，預(yù)冷是冰鮮雞質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。經(jīng)過預(yù)冷減菌工藝環(huán)節(jié)后，雞胴體表面微生物的生長得到抑制，貯藏期得到延長，品質(zhì)得到良好的保持[2]。目前，水冷是我國生鮮禽生產(chǎn)最常用的預(yù)冷方式。預(yù)冷工序采用前后兩段式，兩段水均為流動水，一階預(yù)冷池水溫18 ℃，二階預(yù)冷池水溫10 ℃。水的流動方向與雞胴體流動的方向相反。其中前段預(yù)冷水主要用次氯酸鈉減菌消毒，后段為浸泡清洗[3]。胴體在預(yù)冷工序中所花時間約為20 min。宰殺的生鮮雞通過預(yù)冷水后，降低了部分微生物的含量如葡萄球菌和腸桿菌等[4]，但隨著預(yù)冷時間的增長，預(yù)冷水中的部分微生物含量增高，這時預(yù)冷水已經(jīng)失去了清洗的作用，可能會對生產(chǎn)后期的雞肉造成污染[5]。因此研究預(yù)冷水及冰鮮雞預(yù)冷過程中的微生物組成及動態(tài)變化是揭示冰鮮雞質(zhì)量安全與腐敗菌群的關(guān)系，保證冰鮮雞品質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵。

傳統(tǒng)方法分析微生物群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)需要先對可培養(yǎng)微生物進行分離、鑒定，再進行分析，并不能全面評估微生物群落的組成及結(jié)構(gòu)[6?7]。高通量測序法近來作為一種新的分子生物技術(shù)，具有高效、快速、通量高的特點[8]，能對整個樣品中的微生物種類和相對數(shù)量有一定的分析，可以更全面地反映微生物的群落特征[9]。目前高通量測序應(yīng)用于香腸、龍蝦、鯽魚等[10?12]微生物群落分析中。但鮮有報道將高通量測序技術(shù)運用到測定肉雞屠宰預(yù)冷過程中預(yù)冷水、雞胴體的微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析的研究中。

本文采用高通量測序的方法對江蘇某冰鮮雞加工廠，肉雞屠宰預(yù)冷過程中預(yù)冷水、雞胴體的微生物群落結(jié)構(gòu)進行動態(tài)分析，研究二者優(yōu)勢菌群的消長規(guī)律，為預(yù)冷工序的優(yōu)化提供參考依據(jù)，同時為冰鮮雞產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃母雞（日齡115 d，均重1000~1200 g） 某大型活禽屠宰車間；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋有限公司；氯化鈉 廣東光華科技股份有限公司；Omega Stool DNA Kit試劑盒、2 × Taq Plus Master Mix 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

UniCen MR臺式冷凍離心機 德國Herolab公司； LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；WGZ-200AP濁度儀 上海元析儀器有限公司；HZ-9211K型恒溫振蕩器 太倉科教器材廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；T-25數(shù)顯勻漿器 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 從江蘇某冰鮮雞屠宰加工企業(yè)的預(yù)冷環(huán)節(jié)取樣（環(huán)境溫度為15 ℃）。在凈膛間分別用紅、黃、藍、桔、綠色腳環(huán)綁雞爪做標記，每種顏色腳環(huán)綁定5只雞，分批次進入預(yù)冷水，上一批和下一批測定時間間隔為2 h。第一批紅色腳環(huán)雞剛進預(yù)冷水（每批雞為1000只）時開始計時，一階預(yù)冷水處理15 min，二階預(yù)冷水處理15 min；通過一階預(yù)冷水時，取一階預(yù)冷水樣置于無菌取樣袋中；通過二階預(yù)冷水時，取二階預(yù)冷水置于無菌取樣袋中；并取通過二階預(yù)冷水5只紅色腳環(huán)雞置于無菌取樣袋中，冰運至實驗室。此后每隔2 h，取第二批、第三批、第四批、第五批雞通過時，一階、二階預(yù)冷水和雞胴體，取樣方法同上。

1.2.2 預(yù)冷水菌落總數(shù)的測定 從每批次的一階、二階預(yù)冷水樣液中各取1 mL樣液依次10 倍梯度稀釋后，選取三個合適的連續(xù)梯度，從每個稀釋度中各取1 mL的稀釋液倒入培養(yǎng)皿，傾注15~20 mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，24~48 h后長出菌體取出計數(shù)。

1.2.3 雞胴體菌落總數(shù)的測定 在 0、2、4、6、8 h時，分別取5只經(jīng)二階預(yù)冷水預(yù)冷后的冰鮮雞，分別稱量其體重加同等質(zhì)量的水稀釋一倍，于搖床(4 ℃，200 r/min)搖晃20 min，而后取上清液依次10倍梯度稀釋，選取三個合適的連續(xù)梯度，從每個稀釋度中各取1 mL的稀釋液移入培養(yǎng)皿，傾注平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后于37 ℃倒置培養(yǎng)，24 ~48 h后長出菌體取出計數(shù)。

1.2.4 濁度的測定 采用WGZ-200型號的濁度儀直接測量一階、二階預(yù)冷水的濁度，每個樣品測定3次，取其平均值。

1.2.5 樣品總DNA的提取及PCR擴增 分別取10 mL一階預(yù)冷水、二階預(yù)冷水、雞胴體在生產(chǎn)0、4、8 h時未稀釋的樣液，在4 ℃，12000 r/min低溫離心15 min去除上清液收集沉淀，質(zhì)檢DNA，將合格樣品置于?80 ℃保存。使用Omega Stool DNA Kit試劑盒提取基因組DNA，使用Nanodrop檢驗DNA質(zhì)量和濃度。以338F和806R(5'－ACTCCTACGGGA GGCAGCAG－3'，5'－GTGGACTACHVGGGTWT CTAAT－3') 作為引物對細菌的16S rDNA V3－V4區(qū)進行序列擴增。PCR 采用25 μL反應(yīng)體系：總DNA 30 ng，2 × Taq Plus Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，添加雙蒸水 7.5 μL 補充至 25 μL。PCR 條件：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性 45 s，55 ℃退火 50 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 28個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。

1.2.6 16 S rDNA測序及菌相分析 首先進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，通過序列拼接、過濾和去嵌合體后得到優(yōu)化序列，然后進行OTU聚類及注釋[13?14]?；诰垲惤Y(jié)果，可以進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析[15?16]；基于注釋結(jié)果，可以得到各水平的分類信息，從而進行樣本組成及樣本間群落結(jié)構(gòu)差異相關(guān)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個指標重復(fù)3次試驗，利用Origin8.0圖形分析處理軟件進行數(shù)據(jù)處理[17]，并用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0[18](IBM公司)對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，進行顯著性比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)的變化

2.1.1 預(yù)冷水中菌落總數(shù)的變化 由圖1A可知，一階、二階預(yù)冷水的菌落總數(shù)與時間呈正相關(guān)，隨著生產(chǎn)時間的延長均呈遞增的趨勢；在生產(chǎn)過程中，二階預(yù)冷水的菌落總數(shù)始終低于一階預(yù)冷水，說明一階預(yù)冷水起到較好的減菌效果。一階預(yù)冷水在第一批雞通過預(yù)冷水時（每批雞為1000只）菌落總數(shù)為3.2 lg CFU/mL，在2 h時菌落總數(shù)上升為4.17 lg CFU/mL，在生產(chǎn)2~6 h時菌落總數(shù)在4.17 lg CFU/mL緩慢增長至4.64 lg CFU/mL，在8 h時，菌落總數(shù)達5.34 lg CFU/mL，高于此時雞胴體的菌落總數(shù)，說明此時的預(yù)冷水失去了清洗減菌的作用，這與王華偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)的預(yù)冷水在前中期的減菌效果良好，但隨生產(chǎn)的進行減菌效果降低最后失去減菌效果的結(jié)果一致。二階預(yù)冷水在第一批雞通過預(yù)冷水0~2 h，菌落總數(shù)從2.0 lg CFU/mL驟升到4.3 lg CFU/mL，推測原因經(jīng)過一階預(yù)冷水的雞胴體菌落總數(shù)仍然較高，進入二階預(yù)冷水后，進一步清洗減菌；在4~8 h時，菌落總數(shù)緩慢上升，說明二階預(yù)冷水菌落總數(shù)在這個時間段內(nèi)漸漸趨于飽和。

圖1 生產(chǎn)過程中預(yù)冷水的菌落總數(shù)(A)、濁度(B)Fig.1 The total number of colonies (A) and turbidity (B) of the pre-cooling water during the production process

由圖1B可知，一、二階預(yù)冷水的濁度與生產(chǎn)時間呈正相關(guān)，隨著生產(chǎn)的進行，預(yù)冷水中的濁度上升；不同生產(chǎn)時間預(yù)冷水的濁度差異性顯著(P<0.05)。一階預(yù)冷水在第一批雞通過預(yù)冷水2 h時濁度為137 NTU，說明雞胴體表面物質(zhì)較多，而一階預(yù)冷水清洗雞胴體后，濁度上升。在生產(chǎn)過程中二階預(yù)冷水的濁度一直低于一階預(yù)冷水，說明雞胴體經(jīng)過一階預(yù)冷后胴體表面雜質(zhì)變少，一階預(yù)冷水起到了良好的清洗效果。

2.1.2 預(yù)冷過程中冰鮮雞菌落總數(shù)的變化 細菌的數(shù)量是產(chǎn)品腐敗的重要指標[20?21]。預(yù)冷過程中雞胴體菌落總數(shù)的變化如圖2所示。預(yù)冷之前，雞胴體的菌落總數(shù)為4.53 lg CFU/mL，經(jīng)預(yù)冷后第一批雞通過預(yù)冷水0 h時，雞胴體的菌落總數(shù)為3.98 lg CFU/mL，說明在0 h時，預(yù)冷水對雞胴體起到了良好減菌作用；隨著生產(chǎn)時間的延長，雞胴體的菌落總數(shù)呈增長的趨勢；與預(yù)冷水的菌落總數(shù)變化趨勢一致，而在生產(chǎn)4 h時雞胴體的菌落總數(shù)為4.3 lg CFU/mL，雖低于預(yù)冷前的菌落總數(shù)，但明顯高于0 h時的菌落總數(shù)，說明隨著時間的延長，預(yù)冷水的減菌效果降低；在6~8 h內(nèi)，雞胴體表面菌落總數(shù)高于（P<0.05）預(yù)冷前，說明預(yù)冷水已經(jīng)失去了清洗減菌的作用，可能會對雞胴體造成交叉污染。

圖2 預(yù)冷過程中冰鮮雞菌落總數(shù)的變化情況Fig.2 Changes in the total number of colony of cold fresh chicken during pre-cooling

2.2 物種注釋

2.2.1 DNA擴增結(jié)果 細菌的16S rDNA具有物種特異性、分子大小適中、突變率低的特點，是鑒定細菌種類理想的分子標簽。樣本的16S rDNAV3-V4區(qū)序列擴增的電泳圖如圖3所示。從圖3中可以看出，PCR產(chǎn)物目標條帶正確，總量滿足建庫需要。

圖3 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PCR amplification products

2.2.2 預(yù)冷水和雞胴體測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計 經(jīng)質(zhì)控處理和OTU聚類，預(yù)冷水和雞胴體細菌的序列統(tǒng)計如表1所示，不同時間的預(yù)冷水和雞胴體，共計30個樣品中一共產(chǎn)生1178個OTU。另外，如圖4所示，30個樣品共得1898265條有效序列，序列長度多在420~440 bp 之間。

圖4 序列分布Fig.4 Sequence distribution

表1 預(yù)冷水和雞胴體不同時間下細菌的序列統(tǒng)計Table 1 Sequence statistics of bacteria in pre-cooled water and chicken carcass at different times

2.2.3 基于屬水平的樣品細菌群落豐度 由圖5A可知，在第一批雞通過預(yù)冷水時，一階預(yù)冷水中主要優(yōu)勢菌有氣單胞菌屬Aeromonas(34.7%)，假單胞菌屬Pseudomonas(23.8%)，不動桿菌屬Acinetobacter(9.03%)；在 4 h 時，Pseudomonas(75.8%)豐度明顯增加，Aeromonas(13.1%)豐度減小，Acinetobacter(2.67%)豐度降低，假單胞菌屬相對豐度比例增大，可能是因為雞胴體中攜帶的假單胞菌在預(yù)冷清洗過程中進入預(yù)冷水，從而使假單胞菌屬的豐度上升成為最主要的優(yōu)勢菌，其他菌落相對豐度的比例減??；在8 h時，Aeromonas(18.1%)豐度明顯下降，說明預(yù)冷對氣單胞菌屬有較好的減菌效果；鏈球菌屬Streptococcus(16%)明顯增加，可能是因為雞胴體攜帶的鏈球菌屬污染了一階預(yù)冷水從而使其豐度明顯增加。

由圖5B可知：二階預(yù)冷水在第一批雞通過預(yù)冷水 0 h時，主要優(yōu)勢菌群Acinetobacter(67.3%)，Pseudomonas(5.76%)，杜搟氏菌屬Duganella(4.46%)，黃桿菌屬Flavobacterium(3.55%)；在 4 h和 8 h時，Acinetobacter豐度分別為27%和16.8%，豐度顯著下降；而Pseudomonas顯著增加，分別為19.1%和29%。說明不動桿菌對溫度敏感，二階預(yù)冷水對其有較好的減菌效果，但對假單胞菌無減菌效果。

從圖5C中可知：初始雞胴體的主要優(yōu)勢菌屬有魏斯氏菌Weissella(28.9%)、乳球菌屬Lactococcus(11.2%)、漫球菌屬Vagococcus(11.1%)、Streptococcus(9.2%)；經(jīng)預(yù)冷后Weissella和Vagococcus相對豐度降低，說明預(yù)冷水對此二種菌屬具有減菌效果；而雞胴體的金黃桿菌屬Chryseobacterium、Pseudomonas和Acinetobacter相對豐度上升，可能是因為其它菌豐度下降所致，同時也說明預(yù)冷水對此三種菌減菌效果不佳；Other豐度增加，說明在8 h時雞胴體菌群的豐富度增加，在8 h時一階預(yù)冷水反而對雞胴體造成了污染。

圖5 一階預(yù)冷水(A)、二階預(yù)冷水(B)和雞胴體(C)基于屬水平的物種組成分析Fig.5 Species composition analysis of first(A) and second order pre-cooling water(B) and chicken carcasses(C) based on genera level

綜上所述，在預(yù)冷后期，Chryseobacterium、Pseu domonas、Acinetobacter上升為雞胴體的優(yōu)勢菌屬，尤其Chryseobacterium與Acinetobacter為條件致病菌[22?23]，在加工過程中應(yīng)采取措施對它們進行控制。

2.3 預(yù)冷水和雞胴體細菌類群的Alpha多樣性分析

2.3.1 稀釋曲線 稀釋性曲線[24]可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理。由圖6A可知：通過上述3個時間段的樣品豐度比較得出，一階預(yù)冷水生產(chǎn)0 h時OTU數(shù)量最多，因此0 h時微生物多樣性豐富度最大，這與一階預(yù)冷水共有OTU分析一致。由圖6B可知，二階預(yù)冷水生產(chǎn)4 h時OTU數(shù)量最多，4 h微生物多樣性豐富度最大。由圖6C可知雞胴體在生產(chǎn)8 h時OTU數(shù)量最多，因此8 h時微生物多樣性豐富度最大。

圖6 一階預(yù)冷水(A)、二階預(yù)冷水(B)和雞胴體(C)的稀釋曲線Fig.6 Dilution curves of first(A) and second order pre-cooling water(B) and chicken carcasses(C)

2.3.2 Shannon曲線 Shannon[25]是反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣本的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性[26]。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。從圖7中可看出：10個樣本的曲線的趨勢先是上升然后趨向平坦，說明測序量足夠大，數(shù)據(jù)真實可靠。一階預(yù)冷水在0 h的Shannon數(shù)值高于4 h，低于8 h，說明一階預(yù)冷水在4 h時減菌效果較好，對部分微生物有減菌作用所以導(dǎo)致微生物多樣性降低；而在8 h時減菌效果較差。

圖7 一階預(yù)冷水(A)、二階預(yù)冷水(B)和雞胴體(C)的shannon曲線Fig.7 Shannon curves of first-order pre-cooled water (A), second-order pre-cooled water (B) and chicken carcass (C)

二階預(yù)冷水在4 h和8 h的Shannon數(shù)值高于0 h，這可能是因為二階預(yù)冷水在4 h和8 h的減菌效果不佳。與預(yù)冷前相比，雞胴體在0 h和4 h的Shannon數(shù)值較高，說明預(yù)冷水在0 h和4 h時有減菌效果，從而雞胴體微生物多樣性降低；而在8 h時預(yù)冷水失去減菌效果，雞胴體微生物多樣性升高，這與雞胴體菌落總數(shù)分析結(jié)果一致。

2.4 預(yù)冷水和雞胴體細菌類群的Beta多樣性分析

根據(jù)屬水平上的菌群物種組成及相對豐度，采用 UPGMA 方法對各取樣點進行聚類分析[27]，結(jié)果如圖8所示。一階預(yù)冷水、二階預(yù)冷水在冰鮮雞通過預(yù)冷水0 、4 、8 h時分別聚集在同一分支，說明一階預(yù)冷水、二階預(yù)冷水在這三個時間點的菌落組成相似。雞胴體在冰鮮雞通過預(yù)冷水0 h時和不同時間一階預(yù)冷水聚集在同一個分支，說明在雞胴體通過預(yù)冷水0 h時的菌落組成和一階預(yù)冷水菌落組成相似，這可能是因為在0 h是一階預(yù)冷水對雞胴體有減菌作用；4、8 h的雞胴體和二階預(yù)冷水在同一分支，可能是因為4、8 h時二階預(yù)冷水的微生物種類趨于飽和，雞胴體通過二階預(yù)冷水時和二階預(yù)冷水的菌落組成相似，這與二階預(yù)冷水菌落總數(shù)分析結(jié)果一致；預(yù)冷前的雞胴體單獨在一個分支，可能是因為雞胴體沒有通過預(yù)冷水，與預(yù)冷水沒有產(chǎn)生交叉污染，所以預(yù)冷前雞胴體和預(yù)冷水菌落組成差別比較大。

圖8 一階預(yù)冷水(A)、二階預(yù)冷水(B)雞胴體(C)的樣本聚類分析Fig.8 Sample cluster analysis of first-order pre-cooled water(A) and second-order pre-cooled water (B) chicken carcass (C)

3 結(jié)論

通過菌落總數(shù)監(jiān)測一階預(yù)冷水、二階預(yù)冷水、雞胴體在生產(chǎn)過程中總菌數(shù)的動態(tài)變化，隨生產(chǎn)時間延長，一階預(yù)冷水的菌落總數(shù)呈增長的趨勢，在生產(chǎn)4 h時后預(yù)冷水失去了減菌作用。二階預(yù)冷水的菌落總數(shù)隨生產(chǎn)時間的延長呈遞增的趨勢，在0~2 h內(nèi)對雞胴體有一定的減菌效果，在4~8 h時內(nèi)二階預(yù)冷水的菌落總數(shù)趨于飽和。雞胴體變化趨勢與一階預(yù)冷水變化趨勢相對應(yīng)，這與姚麗峰等[28]研究中后續(xù)的沖洗和預(yù)冷工序未起到較好的減菌效果結(jié)果一致。

通過高通量測序技術(shù)對預(yù)冷水和雞胴體不同生產(chǎn)時間的菌群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進行分析，從屬水平上看，隨著生產(chǎn)進行，一階、二階預(yù)冷水中假單胞菌屬、鏈球菌屬、假節(jié)桿菌屬豐度增加，可能是因為雞胴體中的微生物清洗入預(yù)冷水所致，同時也說明預(yù)冷對這三種菌減菌效果不明顯。雞胴體經(jīng)預(yù)冷后漫球菌屬、魏斯氏菌減少，金黃桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬增加，說明預(yù)冷工藝對漫球菌屬、魏斯氏菌有較好的減菌效果，對黃桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬減菌效果不佳，這可能會成為貯藏過程中的潛在污染菌[29]。其中鏈球菌屬中主要A群鏈球菌和肺炎鏈球菌對人體有致病性[30]，所以可進一步研究雞胴體表面鏈球菌屬的致病性。

預(yù)冷是冰鮮雞加工過程中質(zhì)量安全控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[31]，從群落結(jié)構(gòu)動態(tài)分析可以看出，在預(yù)冷后期控制不動桿菌屬、金黃色桿菌屬、假單胞菌屬等優(yōu)勢菌屬的生長，減少雞胴體和預(yù)冷水的交叉污染尤為重要。此外，在本研究的基礎(chǔ)上，可對預(yù)冷后期污染嚴重的預(yù)冷水進行膜處理后回流至預(yù)冷池進行循環(huán)利用，改善預(yù)冷工藝及降低冰鮮雞的初始菌株、延長其貨架期的問題進行進一步研究。