白藜蘆醇對急性肺損傷大鼠的抗炎作用研究

朱詩乒　樓雅芳　黃小芳　丁旭春　胡晶晶　鄧浩然　蔡宛如

[摘要] [關(guān)鍵詞] 急性肺損傷;大鼠;白藜蘆醇;腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號] R331? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）27-0034-03

The anti-inflammatory effects study of resveratrol on acute lung injury rats

ZHU Shiping1? ?LOU Yafang1? ?HUANG Xiaofang1? ?DING Xuchun1? ?HU Jingjing1? ?DENG Haoran1? ?CAI Wanru2

1.Department of Respiratory Medicine，Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou?; ?310007，China;2.Department of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou? ?310005，China

[Abstract] Objective To evaluate the protective efficacy of resveratrol，an effective component of polygonum cuspidatum，on acute lung injury through animal experiments. Methods A total of 40 SD rats were randomly divided into the blank group（n=10），the model group （n=10），the solvent control group （n=10） and the resveratrol treatment group （n=10）. The acute lung injury model was established by intratracheal instillation of lipopolysaccharide （LPS）. The solvent group was intraperitoneally injected with monomer dissolvent agent （fat emulsion），while the resveratrol treatment group was intraperitoneally injected with resveratrol and solubilizer. They were injected intraperitoneally 24 hours before，during and within 24 hours after the model was established. Samples were collected 48 hours after the model was established. Meanwhile，the lung tissues were examined by pathological staining，and the neutrophil ratio，tumor necrosis factor-α （TNF-α） and lactate dehydrogenase （LDH） contents in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected. Results The neutrophil ratio and TNF-α in BALF of resveratrol treatment group were （68.432±20.623），（92.644±11.322）ng/L，which were higher than those of （87.023±4.032），（106.654±4.606）ng/L in the solvent control group，with statistically significant differences （P<0.05）. There was no statistically significant difference in LDH values between the two groups of BALF（P>0.05）.? Conclusion Resveratrol treatment group can significantly reduce pulmonary interstitial inflammatory cell infiltration，pulmonary interstitial edema，bronchoalveolar wall thickening and bronchoalveolar cavity destruction degree. Resveratrol has certain anti-inflammatory efficacy on rats with acute lung injury.

[Key words] Acute lung injury; Rats; Resveratrol; Tumor necrosis factor-α

肺部炎癥進(jìn)展導(dǎo)致氧氣交換功能障礙并引起嚴(yán)重低氧血癥是急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）重要特征，其作為呼吸系統(tǒng)危急重癥疾病，臨床預(yù)后差，病死率居高不下[1]，防治本類疾病具有非常重要的臨床意義。ALI的具體疾病機(jī)制尚未闡明，迄今為止缺乏有效的治療藥物和手段。天然藥物存在一定的治療前景，基于前期研究，已證明中藥“虎杖”其復(fù)方中藥制劑可抑制急性肺損傷大鼠肺部炎癥反應(yīng)，顯示出一定的抗炎治療作用[2-3]。但是，其具體單體及機(jī)制尚未闡明。白藜蘆醇是虎杖的重要活性成分，也是其主要成分。在國外的相關(guān)試驗證實白藜蘆醇具有較強(qiáng)的抗炎活性，但是，其在急性肺損傷中的研究還不多見。因此，本研究通過SD大鼠的急性肺損傷模型評價白藜蘆醇對肺炎炎癥的保護(hù)作用，為進(jìn)一步探討其相關(guān)作用機(jī)制提供基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

40只清潔級健康雄性SD大鼠（由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：2011A033），體重為（200±20）g。本實驗經(jīng)過動物倫理委員會審批通過。

1.2試劑和藥物

白藜蘆醇（98%分析純）;LPS;液態(tài)異氟烷;脂肪乳（250 mL∶50 g大豆油，3 g卵磷脂）;LDH測定試劑盒;TNF-α ELISA測定試劑盒;生理鹽水等。

1.3 實驗儀器

冰箱;孵育箱;大鼠灌胃器;電子天平稱;燒杯;離心機(jī);酶標(biāo)儀;液態(tài)霧化吸入裝置;移液槍;光學(xué)顯微鏡;自動包埋機(jī);切片機(jī);玻片等。

1.4模型建立

隨機(jī)將40只SD大鼠分為4組，每組各10只，分別為空白對照組、肺損傷模型組、溶劑對照組和白藜蘆醇治療組。將肺損傷模型組、溶劑對照組和白藜蘆醇治療組大鼠進(jìn)行急性肺損傷造模。方法如下：液態(tài)霧化裝置霧化異氟烷并讓大鼠吸入麻醉，除毛消毒后進(jìn)行氣管分離及切開;LPS溶液（配置1 mg/mL濃度）通過1 mL針筒緩慢注射入大鼠氣管中（1.5 mg/kg劑量），將切口縫合消毒后并將大鼠輕輕擺動，使其能夠在大鼠肺組織中均勻分布?？瞻讓φ战M小鼠不進(jìn)行造模。

1.5給藥方法

將白藜蘆醇溶解于脂肪乳劑中（配置1 mg/mL濃度），除了空白對照組外，其余各組大鼠均在造模前24 h、造模時以及造模后24 h 3個時間點進(jìn)行腹腔內(nèi)給藥（劑量10 mg/kg）。

1.6 標(biāo)本收集

在造模完成48 h后，麻醉大鼠并將大鼠進(jìn)行解剖，暴露肺部收集標(biāo)本：①肺部組織：取左上肺葉分剪成三段，進(jìn)行HE染色;②肺泡灌洗液：結(jié)扎左上支氣管，用生理鹽水在右側(cè)及左下肺行肺泡灌洗，將灌洗液搖勻并放入離心管中，低速離心后取上層清液，可保存于-80℃冰箱中。

1.7實驗指標(biāo)

1.7.1 病理檢查? 大鼠肺組織需要進(jìn)行HE染色，顯微鏡觀察其肺部組織病理改變。

1.7.2 BALF中性粒細(xì)胞比值、TNF-α及LDH? 將肺泡灌洗洗液離心，用移液槍吸出細(xì)胞沉渣約1 mL并鋪展于玻片上，風(fēng)干后對細(xì)胞進(jìn)行瑞氏染色，計算出中性粒細(xì)胞比值。采用酶聯(lián)免疫法檢測肺泡灌洗液中TNF-α含量;檢測肺泡灌洗液中LDH含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗;計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察HE染色

①空白對照組：肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁無明顯水腫及充血。②肺損傷模型組：肺泡腔結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，肺泡相互融合，肺泡間隔增寬明顯，肺間質(zhì)見大量的炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）浸潤及出血，肺泡腔內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）浸潤及出血，充血水腫明顯。③溶劑對照組：與肺損傷模型組相比病理改變大致相同。④白藜蘆醇治療組：肺泡結(jié)構(gòu)的破壞、肺泡壁炎癥增厚及充血水腫、肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤及出血均較溶劑對照組有所減輕。見封三圖6。

2.2各組大鼠BALF中性粒細(xì)胞數(shù)百分比、TNF-α及LDH含量比較

空白對照組BALF中性粒細(xì)胞數(shù)百分比、TNF-α及LDH含量最低，與肺損傷模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002、0.002、0.001<0.01）;溶劑對照組中性粒細(xì)胞數(shù)百分比、TNF-α及LDH含量較肺損傷模型組無明顯差異（P=0.679、0.569、0.382>0.05），提示溶劑對ALI無治療作用。白藜蘆醇治療組中性粒細(xì)胞數(shù)百分比、TNF-α與溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003、0.007<0.01）。白藜蘆醇治療組LDH與溶劑對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.256>0.05）。見表1。

3 討論

在ALI發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)始終是重要的啟動及發(fā)展因素，且需要各種炎癥調(diào)控通路（如NF-κB通路等）的參與調(diào)控[4]。其中細(xì)菌感染引起的急性肺損傷在臨床上最為多見[5]，LPS可以刺激氣道上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞[6]，使其過量產(chǎn)生趨化因子和炎癥因子[7]，進(jìn)而引起并發(fā)展成炎癥因子瀑布，甚至引起死亡。其中，中性粒細(xì)胞是由LPS介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)過程中最為重要的炎癥細(xì)胞，是ALI發(fā)生炎癥反應(yīng)時最先被募集的細(xì)胞，其通過釋放蛋白酶加重炎癥反應(yīng)，還可遷移到肺部進(jìn)行脫顆粒進(jìn)一步釋放炎癥介質(zhì)（殺菌蛋白、細(xì)胞因子和活性氧）引起促炎反應(yīng)。因此，其在肺泡中的含量能夠反映肺組織的炎癥程度[8]。當(dāng)肺部炎癥進(jìn)一步加重時，活化的肺泡巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β，使肺泡中其他細(xì)胞（如肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等）產(chǎn)生趨化因子，激活炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞不斷遷移至肺部，擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步損傷相關(guān)組織細(xì)胞，從而導(dǎo)致肺組織的進(jìn)一步損害[9]。在促炎因子中，以TNF-α最為顯著，是炎癥反應(yīng)中具有始動和關(guān)鍵性作用的促炎因子，其能聚集并激活中性粒細(xì)胞，引起肺泡細(xì)胞的溶解，促使更多炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)募集遷移及血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子爆發(fā)式釋放從而加劇肺損傷。因此，其是急性肺損傷炎癥反應(yīng)過程中最為重要的標(biāo)志物之一[10]。

另外，在LPS導(dǎo)致的ALI中，肺臟內(nèi)聚集了大量中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生并釋放大量氧自由基（Oxygen free radical，OFR），引起肺組織內(nèi)氧化及抗氧化系統(tǒng)失去平衡[11]。大量的活性氧促發(fā)脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起血及肺組織中LDH含量增加[12]。因此肺組織中LDH含量可反映肺部炎癥損傷時其氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡程度。

通過前期的基礎(chǔ)實驗研究發(fā)現(xiàn)，虎杖及其中藥復(fù)方可以減輕動物模型的急性肺損傷引起的肺部炎癥反應(yīng)，具有一定的抗炎作用，但其具體中藥活性單體及具體作用機(jī)制尚不十分明確[13]。國外的相關(guān)研究證明，白藜蘆醇具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠清除自由基并對花生四烯酸代謝產(chǎn)生影響，從而使DNA免受損傷[14-15]，其是一種抑炎因子，相關(guān)研究證實其可直接抑制炎癥反應(yīng)[16]。國內(nèi)有學(xué)者證實，其能抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而達(dá)到抗炎作用[17-18]，但其對于急性肺損傷的抗炎研究鮮見報道[19-20]。

本研究結(jié)果證實，白藜蘆醇對急性肺損傷大鼠肺部的抗炎保護(hù)作用，在組織病理學(xué)上，白藜蘆醇治療組大鼠的肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、充血水腫、呼吸膜增厚、肺泡腔結(jié)構(gòu)破壞程度等一系列病理改變得到改善。在細(xì)胞層面能夠降低大鼠肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞比值，在炎癥因子層面，其能有效降低肺泡灌洗液中的TNF-α。以上數(shù)據(jù)均提示白藜蘆醇在急性肺損傷大鼠中顯示出一定抗炎保護(hù)作用。值得注意的是，本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇治療組較溶劑對照組的肺泡灌洗液中的乳酸脫氫酶（LDH）雖有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示在急性肺損傷中，白藜蘆醇對大鼠肺組織保護(hù)很可能與抗炎作用相關(guān)，而與其抗氧化作用是否有直接關(guān)系需要通過進(jìn)一步大樣本量實驗研究證實。

綜上所述，白藜蘆醇對急性肺損傷具有抗炎保護(hù)作用，其具體機(jī)制可能與降低肺組織中TNF-α等重要的促炎因子相關(guān)，具體炎癥通路需要進(jìn)一步實驗證實。

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（收稿日期：2020-10-28）