易被誤判為三等位基因的分型結(jié)果1 例

孫烈婷，王文婷，陳曼，王芳，劉瑩

1.甘肅迪安同享醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心司法鑒定所，甘肅 蘭州 730000；2.迪安鑒定科學(xué)研究院，浙江 杭州 310000；3.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京100000

1 案 例

1.1 簡(jiǎn)要案情

因親緣關(guān)系鑒定需要，被檢父姚某、孩子母親梁某及孩子要求進(jìn)行親子鑒定，采集末梢血，制成血卡，陰干后避光干燥保存。

1.2 檢驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果

1.2.1 初次檢驗(yàn)

使用MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)（北京閱微基因技術(shù)有限公司）復(fù)合擴(kuò)增3 人血樣基因座，反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置。使用3130xl基因分析儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，GeneMapper?ID-X軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）分析電泳結(jié)果，等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（ladder，北京閱微基因技術(shù)有限公司）及血樣分型的相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1。

圖1 MicroreaderTM 21 ID 系統(tǒng)檢測(cè)圖譜Fig.1 Genotyping of MicroreaderTM 21 ID System

母親與孩子在FGA基因座分型分別為“17.2，22，24.2”及“17.2，24，24.2”，出現(xiàn)3 個(gè)等位基因，其他基因座未出現(xiàn)明顯異常，更換試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 復(fù)檢

采用人類(lèi)DNA 分型盒（白金）（深圳華大法醫(yī)科技有限公司）重新擴(kuò)增母親與孩子血樣（圖2）發(fā)現(xiàn)，母子FGA基因座分型為“22，24.2”“24，24.2”，均為雜合子，沒(méi)有MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)檢測(cè)出的“17.2”等位基因，在vWA基因座卻出現(xiàn)三等位基因現(xiàn)象。對(duì)照MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)分型結(jié)果，母親及孩子vWA基因座分型在“14，18”及“14，17”以外，均出現(xiàn)了一個(gè)off-ladder 峰（以下簡(jiǎn)稱(chēng)OL 峰），片段長(zhǎng)度分別為305.93、305.78 bp，按照片段長(zhǎng)度，應(yīng)標(biāo)記為14.2。

圖2 人類(lèi)DNA 分型盒（白金）檢測(cè)圖譜Fig.2 Genotyping of Human DNA Typing Kit（Platinum）

比對(duì)初次檢驗(yàn)與復(fù)檢結(jié)果，推測(cè)2 個(gè)基因座的三等位基因中的一個(gè)來(lái)自較目標(biāo)基因座片段稍短的D2S1338。

1.2.3 測(cè)序與結(jié)果

將母親與孩子的樣本的D2S1338基因座進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果顯示：母親與孩子的D2S1338基因座均分別檢出18、36 個(gè)重復(fù)單位，其中等位基因18 包括7 個(gè)TGCC 重復(fù)和11 個(gè)TTCC 重復(fù)；母親的等位基因36 包 括7 個(gè)TGCC 重 復(fù)、27 個(gè)TTCC 重 復(fù) 和2 個(gè)GTCC重復(fù)；孩子的等位基因36 包括7 個(gè)TGCC 重復(fù)、26 個(gè)TTCC 重復(fù)、1 個(gè)TTAC 重復(fù)和2 個(gè)GTCC 重復(fù)。

1.2.4 鑒定意見(jiàn)

根據(jù)母親參與下累積父權(quán)指數(shù)（cumulative paternity index，CPI）計(jì)算公式[1]，計(jì)算得到CPI值為1.70×1010，支持被檢父為孩子的生物學(xué)父親。

2 討論

短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）是廣泛存在于人類(lèi)基因組中的一類(lèi)具有高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，具有分布廣泛、多態(tài)性高、可復(fù)合擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，是目前全世界法醫(yī)DNA 實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用最廣泛的一類(lèi)遺傳標(biāo)記[2]。一般情況下，人常染色體單個(gè)STR 基因座的等位基因分型表現(xiàn)為純合子或雜合子，純合子含有兩個(gè)相同的等位基因（約占10%），雜合子即含有兩個(gè)不同的等位基因（約占90%）[3]。在極個(gè)別情況下，單個(gè)STR 分型圖譜會(huì)出現(xiàn)3 條等位基因，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[4-6]推測(cè)是由于染色體非整倍體、減數(shù)分裂期間同源染色體發(fā)生錯(cuò)位配對(duì)和重組而造成染色體內(nèi)部分片段重復(fù)、嵌合體以及體細(xì)胞突變等原因形成。

本案中，MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)檢測(cè)的FGA基因座分型結(jié)果出現(xiàn)三等位基因，用人類(lèi)DNA 分型盒（白金）驗(yàn)證，該基因座出現(xiàn)正常的雜合分型，而原正常雜合分型的vWA基因座出現(xiàn)了三等位基因，推測(cè)兩個(gè)基因座可能并非真正存在三等位基因。在MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)檢測(cè)圖譜中，出現(xiàn)三等位基因的FGA基因座為紅色熒光標(biāo)記的最大片段基因座，其后無(wú)相同熒光標(biāo)記的基因座，比FGA基因座片段稍短的D2S1338基因座只有1 個(gè)等位基因；在人類(lèi)DNA 分型盒（白金）檢測(cè)圖譜中，vWA基因座出現(xiàn)三等位基因，較vWA片段稍長(zhǎng)的Penta E基因座有峰值比較接近的兩個(gè)等位基因，比vWA基因座片段稍短的D2S1338基因座同樣只有1 個(gè)等位基因，其余均無(wú)異常?？梢钥闯觯? 種試劑盒出現(xiàn)三等位基因的基因座均與D2S1338相鄰，且該基因座只檢出1個(gè)等位基因。推測(cè)FGA和vWA基因座異常增加的等位基因可能來(lái)自D2S1338基因座。根據(jù)2 種試劑盒等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，分別計(jì)算異常等位基因，其結(jié)果均為36個(gè)重復(fù)單位。

通過(guò)克隆測(cè)序檢測(cè)D2S1338基因座序列，得到準(zhǔn)確的等位基因分型，證實(shí)了上述結(jié)果。在D2S1338基因座等位基因36 中，核心重復(fù)序列與《法醫(yī)物證學(xué)》[7]中提到D2S1338基因座核心序列TTCC 及TGCC 不同。本案中，母親及孩子的D2S1338基因座等位基因36 除了上述2 種核心序列，還出現(xiàn)了GTCC 及TTAC。另外，發(fā)現(xiàn)母子核心序列不一致。母親為7 個(gè)TGCC重復(fù)、27 個(gè)TTCC 重復(fù)和2 個(gè)GTCC 重復(fù)，孩子為7 個(gè)TGCC重復(fù)、26個(gè)TTCC重復(fù)、1 個(gè)TTAC 重復(fù)和2 個(gè)GTCC 重復(fù)，母子的TTCC 重復(fù)數(shù)量不同，推測(cè)應(yīng)該是1 個(gè)TTCC 核心序列中C 堿基突變?yōu)锳，導(dǎo)致以上結(jié)果。

通過(guò)本案例，提示在實(shí)際檢案工作中對(duì)于檢測(cè)出的三等位基因，必須采用其他試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，排除擴(kuò)增及檢測(cè)過(guò)程造成的漂移，甚至如本案這種非常稀有的超長(zhǎng)基因等情況，必要時(shí)應(yīng)通過(guò)測(cè)序確定基因座序列，使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確。