葛新國(guó) 原小斌

膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cancer，BUC)是膀胱癌常見形式[1],預(yù)后很差。細(xì)胞分裂周期蛋白20(cell division cycle protein 20，CDC20)可激活促進(jìn)復(fù)合物(anaphase-promoting complex，APC/C)啟動(dòng)細(xì)胞分裂G2/M期。有證據(jù)表明，CDC20可能成為一個(gè)很有前途的腫瘤治療靶點(diǎn)[2]。CDC20的異常表達(dá)可能會(huì)擾亂APC/C的激活。有研究報(bào)道了其在前列腺癌、肝細(xì)胞癌中過度表達(dá)[3]。miR-34a-5p上調(diào)表達(dá)后，可有效抑制人肺癌H460細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡[4]。經(jīng)miRTarBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-34a-5p與CDC20存在結(jié)合位點(diǎn)。本研究檢測(cè)BUC病人組織中CDC20、miR-34a-5p的表達(dá)，并分析二者與臨床病理的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2015年2月～2017年2月本院腫瘤科收治的BUC病人80例，均接受手術(shù)治療，術(shù)中留取癌組織(BUC組)及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織(對(duì)照組，距離癌緣2.5 cm)。其中男56例，女24例，年齡43～79歲；組織學(xué)分級(jí)：高級(jí)別53例，低級(jí)別27例；發(fā)生在膀胱39例、腎盂27例、輸尿管14例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后經(jīng)病理切片證實(shí)為BUC；(2)術(shù)前未在本院或其他醫(yī)院接受放療、化療或分子靶向治療；(3)病歷資料完整，有完整隨訪記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并前列腺癌、腎細(xì)胞癌等其他癌癥；有嚴(yán)重的心腦血管疾病、肝腎疾?。缓喜⒆陨砻庖咝约膊?。病人及家屬知情并同意簽字，本研究經(jīng)本院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

二、方法

1.主要試劑與儀器：Trizol試劑(美國(guó)Invirotrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海吉至生化科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)；CDC20兔抗人一抗、羊抗兔IgG二抗(英國(guó)Abcam公司)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(Streptavidin-peroxidase linkage method，SP)試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(貨號(hào)DAB002，合肥康源生物科技研究所)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)7300型，美國(guó)Applied biosygtems公司)；奧林巴斯顯微鏡(型號(hào)BX51、TSX40086V，日本奧林巴斯株式會(huì)社)；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

2.樣品采集及保存：所有樣本均為手術(shù)中切除新鮮組織樣本，經(jīng)10%甲醛固定4～6小時(shí)，梯度脫水，組織浸蠟，石蠟包埋，剩余組織保存于-80 ℃冰箱備用。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)BUC組織中CDC20 mRNA、miR-34a-5p表達(dá)水平。參照SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，內(nèi)參分別選用GAPDH、U6基因，CDC20 mRNA、miR-34a-5p、GAPDH、U6引物序列見表1。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算BUC組織中CDC20 mRNA、miR-34a-5p相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

4.免疫組化法(S-P法)檢測(cè)BUC病人組織中CDC20的表達(dá)：以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。染色指數(shù)(staining index，SI)為陽性細(xì)胞表達(dá)百分比評(píng)分與著色強(qiáng)度評(píng)分乘積。

5.隨訪：通過門診復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪，開始于2015年2月，每2～3個(gè)月隨訪1次，截至2020年2月。隨訪期間，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例；31例病人死亡(21例死于BUC，10例死于心血管疾病或意外等其他原因)；無失訪。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

1.CDC20和miR-34a-5p水平：BUC組組織中CDC20 mRNA為(2.68±0.35)，對(duì)照組為(1.05±0.19)，miR-34a-5p分別為(0.42±0.08)和(1.08±0.11)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.CDC20 mRNA和miR-34a-5p水平相關(guān)性：Pearson法分析顯示，miR-34a-5p、CDC20 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.696，P<0.05)。

3.CDC20在癌旁正常組織及BUC組織中的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示，BUC組織中CDC20陽性率高于癌旁正常組織(76.25% vs 18.75%，χ2=53.033，P<0.05)。見圖1。

圖1 CDC20在癌旁正常組織及BUC組織中的表達(dá)(S-P法×200)

4.BUC組織中CDC20、miR-34a-5p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：以SI<2為陰性表達(dá)，SI≥2為陽性表達(dá)，分為CDC20陰性組(19例)和陽性組(61例)；以BUC組miR-34a-5p表達(dá)平均值為界值，分為miR-34a-5p低表達(dá)組(41例)與高表達(dá)組(39例)。BUC病人中CDC20、miR-34a-5p表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、組織浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、病變部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 BUC組織中CDC20、miR-34a-5p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)

5.BUC組織中CDC20、miR-34a-5p表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系：K-M法分析顯示，BUC病人3年累積生存率為61.25%(49/80)，CDC20陽性表達(dá)病人3年累積生存率低于CDC20陰性表達(dá)病人(52.46% vs 94.74%，Log-rank χ2=9.318，P<0.05)；miR-34a-5p高表達(dá)病人3年累積生存率高于miR-34a-5p低表達(dá)病人(87.18% vs 48.78%，Log-rank χ2=13.434，P<0.05)。見圖2。

圖2 BUC組織中CDC20、miR-34a-5p表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

6.Cox回歸分析BUC病人預(yù)后的影響因素：?jiǎn)我蛩谻ox分析顯示，病變部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)、CDC20、miR-34a-5p均是影響B(tài)UC不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素；多因素Cox分析顯示，CDC20水平偏高、miR-34a-5p水平偏低是BUC不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(HR=2.635、3.426，P<0.05)。見表3。

表3 Cox回歸分析BUC病人預(yù)后的影響因素

討論

BUC是膀胱癌的主要類型，為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[5]。BUC病人通常表現(xiàn)為無痛性血尿，診斷常被延誤。目前，膀胱癌的疾病管理主要依賴于積極的治療，以及根據(jù)疾病的分期和等級(jí)進(jìn)行手術(shù)[6]。

有研究發(fā)現(xiàn)，CDC20在宮頸高級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變和鱗狀細(xì)胞癌中上調(diào)[7]。CDC20的高表達(dá)與前列腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后不良相關(guān)[2,8-10]。miRNA通過引起靶mRNA的降解或通過其特異性結(jié)合來抑制其翻譯而充當(dāng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子[11]。miR-34a包含miR-34a-3p和miR-34a-5p兩種形式，其強(qiáng)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細(xì)胞增殖[12]。miR-34a-5p來源于miR-34a，可以阻止腫瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲[13]。本研究結(jié)果提示，CDC20、miR-34a-5p可能與BUC的發(fā)生有關(guān)。免疫組化結(jié)果表明，CDC20可能參與BUC的發(fā)病過程。BUC病人CDC20、miR-34a-5p表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、組織浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。提示二者可能參與了BUC的發(fā)生、發(fā)展過程，可能與CDC20高表達(dá)、miR-34a-5p低表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。

Lee等[14]研究了上尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma ，UTUC)，發(fā)現(xiàn)病人組織中317個(gè)差異表達(dá)的基因，神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子SLIT3的低表達(dá)是BUC病人生存率差異的預(yù)測(cè)因子，而miR-34a-5p是其潛在的調(diào)節(jié)因子，推斷miR-34a-5p在UTUC中具有潛在的預(yù)后診斷價(jià)值。本研究經(jīng)K-M法分析顯示,CDC20、miR-34a-5p的異常表達(dá)與BUC病人生存率有關(guān)。Cox分析提示,CDC20、miR-34a-5p水平異?？赡芘cBUC不良預(yù)后有關(guān)，具有潛在的診斷價(jià)值。

綜上所述，BUC病人癌組織較正常組織中CDC20 mRNA和蛋白水平升高、miR-34a-5p水平降低。CDC20、miR-34a-5p與BUC組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后密切相關(guān)，具有潛在的診斷價(jià)值。本研究也存在未檢測(cè)血清中CDC20、miR-34a-5p的水平的不足，所以對(duì)發(fā)生BUC的預(yù)測(cè)價(jià)值不足。