謝鳳嬌 鄭日妹 葉樹柳

廣東天益生物科技有限公司 廣東湛江 524300

紅曲色素是中國的傳統(tǒng)食品色素，是通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)并達(dá)到廣泛應(yīng)用的最為成功的天然色素之一。日本、韓國、朝鮮、東南亞及中國港澳地區(qū)應(yīng)用較普遍，在許多亞洲國家已經(jīng)合法化。歐美許多國家現(xiàn)已將紅曲米粉用于肉制品工業(yè)，取得了滿意的效果。但是紅曲產(chǎn)品中含有生物毒素——桔青霉素，此生物毒素具有腎毒性，還可致畸、致癌和誘發(fā)基因突變等[1]，成為出口產(chǎn)品的重要制約因素。

深層發(fā)酵法在紅曲色素產(chǎn)業(yè)化中的應(yīng)用已經(jīng)有二十多年的歷史，其工藝已日趨成熟、穩(wěn)定。液態(tài)發(fā)酵具有周期短、產(chǎn)量高、雜質(zhì)少、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點；可以實現(xiàn)生產(chǎn)自動化，提高產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，擴大了生產(chǎn)規(guī)模；配方、工藝可控性強，不僅可以達(dá)到高色素濃度的發(fā)酵水平[2]，而且能控制桔青霉素的含量。目前中國紅曲紅色素、紅曲黃色素的國家標(biāo)準(zhǔn)中已明確規(guī)定了桔青霉素含量的限量，深層液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)品能穩(wěn)定控制桔青霉素含量在標(biāo)準(zhǔn)要求的范圍之內(nèi)。

目前紅曲米粉的生產(chǎn)方式主要是固態(tài)發(fā)酵工藝，采用通風(fēng)制曲發(fā)酵，在通風(fēng)曲池內(nèi)完成發(fā)酵培養(yǎng)過程[2]，這是目前最為廣泛的固體制曲通風(fēng)培養(yǎng)方式，較地面培養(yǎng)方式大大提高生產(chǎn)效率并縮短生產(chǎn)周期。敞開式發(fā)酵，發(fā)酵過程中控制桔青霉素的含量具有一定的難度，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。市場上銷售的紅曲米粉樣品，檢測桔青霉素含量，其結(jié)果很不樂觀。基于對食品安全角度考慮，類似于紅曲紅色素標(biāo)準(zhǔn)，未來將桔青霉素限量作為指標(biāo)，列入紅曲米粉產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的可能性極大。

在菌種選育的基礎(chǔ)上，通過實驗考察了深層液態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)基配方、工藝參數(shù)等對紅曲米粉中紅曲色素、桔青霉素的影響，摸索液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲米粉的新工藝，期望達(dá)到改善紅曲米粉產(chǎn)品品質(zhì)的目的。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料、試劑、設(shè)備與儀器

1.1.1 菌種

紫紅曲霉菌，廣東天益生物科技有限公司保藏。

1.1.2 材料

葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、玉米漿、硝酸鈉，硫酸鎂、磷酸二氫鉀、乳酸、大米、大豆粉、酵母抽提物、β-環(huán)狀糊精、竹葉抗氧化劑等均為市售。

1.1.3 試劑

無水乙醇，分析純，廣州化學(xué)試劑二廠；

乙腈，色譜純，瑞典歐普森；

免疫親和柱，1mL，美國維康。

1.1.4 設(shè)備與儀器

殺菌鍋YXQ.WY21-600，廣州市華南醫(yī)療器械有限公司；

顯微鏡CX31RBSFA，奧林巴斯；

可見分光光度計722S，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

電子天平mL104/02，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；

酸度計PHS-3C，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

液相色譜儀-熒光檢測器RF-20A，島津企業(yè)管理有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生產(chǎn)工藝流程

原料配制→滅菌→菌種的擴大培養(yǎng)→發(fā)酵→乳化→濃縮→噴霧干燥→粉狀紅曲米粉。

1.2.2 步驟方法

(1)種子液體培養(yǎng)基。具體的配方(按重量比)為：葡萄糖25～40g/L，蛋白胨10～15g/L，玉米漿5～9g/L，硝酸鈉1～5g/L，硫酸鎂7～10g/L，磷酸二氫鉀2～5g/L。用乳酸調(diào)節(jié)pH值為4.0～5.0。

(2)菌種的擴大培養(yǎng)。將試管菌種轉(zhuǎn)移到無菌水中，將其接種至一級液體培養(yǎng)基中(裝液量為50%～60%)，接種量為4%～6%，培養(yǎng)10～15h后接種到二級液體培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)7～15h后，接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，制得發(fā)酵用的液體種子培養(yǎng)液。

種子罐培養(yǎng)條件：通風(fēng)比為1∶(1.0～1.5)，攪拌轉(zhuǎn)速120～180r/min，控制溫度為28～32℃。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備。采用的原料按照質(zhì)量比為：大米粉120～180g/L，大豆粉10～40g/L，玉米漿9～20g/L，蛋白胨10～30g/L，酵母抽提物10～20g/L，硝酸鈉2～6g/L，硫酸鎂2～6g/L，磷酸二氫鉀1～5g/L。用乳酸調(diào)節(jié)pH值為4.0～5.0。

具體的制備過程為：原輔料加水?dāng)嚢枞芙夂蟊萌氚l(fā)酵罐中，裝液量為發(fā)酵罐體積50%～55%即可，通入蒸汽進(jìn)行高溫滅菌。殺菌條件：121～127℃，0.1～0.15MPa，30min；冷卻降溫至40～45℃?zhèn)溆谩?/p>

(4)發(fā)酵。將1.2.2步驟方法(2)中得到的種子培養(yǎng)液接種到1.5m3發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)，始終通入無菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速100～150r/min，溫度(初期28～30℃、中期31～33℃，后期34～35℃)，供氧量為1∶(0.5～0.7)，罐壓0.05～0.07MPa，周期為80～100h，制得液態(tài)紅曲米粉發(fā)酵液。

(5)乳化。將1.2.2步驟方法(4)中得到的產(chǎn)物加入β-環(huán)狀糊精40～65g/L，竹葉抗氧化劑2～5g/L，轉(zhuǎn)速2 500r/min、時間55min。進(jìn)一步采用超聲波處理技術(shù)(40Hz，常溫)，進(jìn)行循環(huán)處理0.5～1h，利用超聲的空化作用和機械效應(yīng)，剪切大分子，大幅度提高乳化效果。使得紅曲米粉在水中的溶解性更強，耐光耐熱性能得到提高。

(6)濃縮。將1.2.2步驟方法(5)中得到的產(chǎn)物采用真空濃縮技術(shù)，溫度40～55℃，真空度為-0.08～-0.095MPa，循環(huán)15～25h。

(7)噴霧干燥。將1.2.2步驟方法(6)中得到的產(chǎn)物采用噴霧干燥技術(shù)，干燥塔進(jìn)風(fēng)溫度180～200℃，出風(fēng)溫度60～80℃，將液體物料進(jìn)行噴霧干燥，得到粉末狀紅曲米粉。

1.3 分析方法

1.3.1 桔青霉素

按照GB5009.222-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中桔青霉素的測定》第一法免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢驗。

1.3.1.1 儀器

高速均質(zhì)器：12 000r高速均質(zhì)。

高效液相色譜儀：配熒光檢測器。

色譜柱：C18柱，柱長150nm，內(nèi)徑4.6nm，粒徑5um，或等效柱。

1.3.1.2 樣品的提取和凈化

按照標(biāo)準(zhǔn)第一法中紅曲及其制品的步驟內(nèi)操作。

1.3.1.3 檢測條件

柱溫30℃，流速0.7mL/min,進(jìn)樣量50uL；激發(fā)波長350nm,發(fā)射波長500nm；流動相A液，100%乙腈；流動相B液，0.1%磷酸。流動相及梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件表

1.3.2 色價和其他指標(biāo)

按照GB1886.19-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲米》標(biāo)準(zhǔn)要求檢驗。發(fā)酵液色價檢驗方法：用10mL刻度吸管準(zhǔn)確吸取發(fā)酵液1mL緩慢放入試管中，再加入9mL(70%)乙醇，搖勻，使之徹底溶解20min，用快速濾紙過濾，按色價的高低變化稀釋倍數(shù)，用722型分光光度計在波長495～505nm測定吸光值[3]。色價計算見公式(1)。

色價(U/mL)=稀釋倍數(shù)×吸光值

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種選育

2.1.1 菌株分離

從紅曲米中用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(麥芽汁10～30g/L，蛋白胨1～5g/L，瓊脂18～20g/L)分離得到菌株，在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，分離適合液態(tài)發(fā)酵工藝的菌株。

2.1.2 菌株純化篩選

分離得到的菌株TY11采用紫外線誘變[4]、耐乳酸pH值3.5～4.5、耐高溫30～50℃等條件進(jìn)行處理，反復(fù)多次重復(fù)實驗，獲得3個菌株分別是TY1112、TY1122、TY1132，最后通過重復(fù)的搖瓶發(fā)酵測試，篩選得到發(fā)酵產(chǎn)色率高、桔青霉素含量低的最佳生產(chǎn)菌株。不同菌株多次搖瓶發(fā)酵液檢驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同菌株多次搖瓶發(fā)酵液檢驗數(shù)據(jù)

表2的數(shù)據(jù)表明：出發(fā)菌株TY11搖瓶發(fā)酵產(chǎn)色價偏低，桔青霉素含量高；經(jīng)過誘變后得到的3支菌株的發(fā)酵產(chǎn)色率提高，桔青霉素含量明顯降低，其中菌株TY1122搖瓶發(fā)酵產(chǎn)色價較高，桔青霉素含量低，重現(xiàn)性較強，說明菌株的性能優(yōu)良。

2.1.3 遺傳穩(wěn)定性實驗

對篩選得到的優(yōu)良菌株TY1122進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實驗。以TY11為對照，將菌種斜面接處5代，分別接種發(fā)酵后，檢測色價及桔青霉素，比較差異。(傳種接代編號Y1為一代，Y2、Y3、Y4、Y5分別為二代、三代、四代、五代)，結(jié)果見表3。

表3 各代菌株色價和桔青霉素含量結(jié)果

表3數(shù)據(jù)結(jié)果表明，誘變菌株TY1122具有穩(wěn)定的遺傳性，無明顯回復(fù)突變，且TY1122較出發(fā)菌株TY11色價提高約80%，能控制桔青霉素含量<0.08mg/kg，是一株高產(chǎn)色素、低產(chǎn)桔青霉素穩(wěn)定的誘變菌株。

2.2 發(fā)酵工藝控制技術(shù)的影響

發(fā)酵工藝控制影響要素主要是培養(yǎng)基配方與操作參數(shù)，供氧量、罐壓等。其中培養(yǎng)基配方還包括碳氮比，而供氧是通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的無菌壓縮空氣來實現(xiàn)。

2.2.1 碳氮比

胡文林[2](2021)等實驗摸索得出紅曲菌發(fā)酵紅曲色素工藝中，碳氮比控制2.5∶1較為合適。培養(yǎng)基中的碳氮比對菌種的生長、代謝尤為關(guān)鍵，同時直接影響代謝產(chǎn)物的顏色和色澤等品質(zhì)。當(dāng)碳氮比失調(diào)時，菌種的發(fā)酵培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)菌絲體形態(tài)異常、產(chǎn)色率低、色澤發(fā)暗、發(fā)酵周期延長等不良現(xiàn)象。綜合固態(tài)發(fā)酵和深層發(fā)酵紅曲紅的工藝，以大米為碳源，大豆、酵母抽提物、蛋白胨等為氮源，選取碳氮比為3∶1～4∶1，用TY1122菌株進(jìn)行紅曲米粉的發(fā)酵配方最佳碳氮比的摸索試驗，通過對菌絲體的形態(tài)、發(fā)酵液顏色和色價、發(fā)酵周期、桔青霉素等指標(biāo)進(jìn)行檢驗分析，結(jié)果如表4。

表4 碳氮比對發(fā)酵結(jié)果的影響

表4的各項數(shù)據(jù)表明：在此實驗條件下，碳氮比不影響桔青霉素的積累。采用碳氮比為3.5∶1時，菌絲體長、粗壯、分枝多，胞內(nèi)紅色素也非常多，說明產(chǎn)色率高，發(fā)酵色價較高，發(fā)酵液的顏色為鮮紅色，直接影響終產(chǎn)品的顏色色澤，發(fā)酵周期雖然不是最短的，但還可以通過其他工藝參數(shù)控制逐步縮短。

2.2.2 供氧

在紅曲菌發(fā)酵過程中，除了碳源和氮源之外，氧也是需要大量供應(yīng)的原料之一，供氧對菌絲體的生長和代謝產(chǎn)物的積累有非常重要的影響，因此供氧量關(guān)系到發(fā)酵的成敗。供氧量主要計算通入發(fā)酵罐的壓縮空氣質(zhì)量。用TY1122菌株，培養(yǎng)基碳氮比為3.5∶1，進(jìn)行發(fā)酵試驗，結(jié)果如表5所示。

表5 供氧量對發(fā)酵結(jié)果的影響

從表5數(shù)據(jù)可知，供氧量在1∶(0.5～0.7)時菌絲體形態(tài)正常、發(fā)酵液色價高、桔青霉素含量低等優(yōu)勢；供氧量為1∶(0.2～0.4)供氧量太小，菌種生長緩慢、發(fā)酵周期明顯延長；供應(yīng)量1∶(1.1～1.3)的發(fā)酵周期最佳，但供氧量太大，菌種生長非?？?，容易提前進(jìn)入衰老期，不利于代謝產(chǎn)物的積累，影響發(fā)酵效價，同時桔青霉素積累增加。另外，高通氣量對設(shè)備的配套要求非常大，能耗高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2.3 罐壓

紅曲菌液態(tài)發(fā)酵過程屬于純種發(fā)酵，需要通入無菌空氣保持發(fā)酵罐處于正壓的狀態(tài)，可以防止發(fā)酵培養(yǎng)基被空氣中的微生物污染而消耗營養(yǎng)物質(zhì)。用TY1122菌株，培養(yǎng)基碳氮比為3.5∶1，供氧量1∶(0.5～0.7)，進(jìn)行發(fā)酵試驗，結(jié)果如表6所示。

表6 罐壓對發(fā)酵液指標(biāo)的影響

表6試驗結(jié)果表明，發(fā)酵罐壓力對桔青霉素積累沒有明顯影響。發(fā)酵罐的壓力保持在0.05～0.07MPa，有利于紅曲菌的生長和發(fā)酵，菌絲體正常生長；罐壓在0.08～1.00MPa，菌絲體生長緩慢、形態(tài)異常，影響代謝產(chǎn)物的分泌。罐壓太低，空氣容易滲入發(fā)酵罐中，增加空氣中雜菌的風(fēng)險，影響紅曲菌的正常生長，導(dǎo)致發(fā)酵失敗。

3 結(jié)論

采用紫外誘變、耐乳酸、耐高溫等壓力篩選獲得優(yōu)良菌種紫紅曲霉菌TY1122。通過對深層發(fā)酵工藝參數(shù)的實驗探索，獲得了優(yōu)化的發(fā)酵工藝：以大米為主要原料，控制發(fā)酵參數(shù)碳氮比為3.5∶1、供氧量1∶(0.5～0.7)、罐壓0.05～0.07MPa，在此條件下，1.5t發(fā)酵罐發(fā)酵的實驗結(jié)果為發(fā)酵液色價>500U/mL。再經(jīng)后處理工藝得到紅曲米粉，其桔青霉素含量<0.080mg/kg。這一菌種與工藝參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)低桔青霉素的紅曲米粉奠定了基礎(chǔ)。