毛坤明

(福建省福清市畜牧獸醫(yī)中心，福建 福清 350300)

鳥類的胚胎發(fā)育完全都在蛋殼內(nèi)完成，胚胎發(fā)育過程中，胚胎外組織的羊膜、漿膜、尿囊膜發(fā)生了急劇的組織形態(tài)學(xué)變化，以適應(yīng)不同發(fā)育階段胚胎的變化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收進入胚體。胚胎外組織的形態(tài)學(xué)變化過程相對恒定，并且對應(yīng)于胚胎正常發(fā)育的特定階段，對應(yīng)于其在蛋殼的特定分布區(qū)域。這個特性被利用于雞鴨鵝等家禽的人工孵化作業(yè)中，在孵化的特定時間點通過“照蛋(Candling)”的工序，觀察胚蛋表面的血管分布以及胚胎投影變化和內(nèi)容物透光情況，以了解胚胎發(fā)育情況[1-2]。同時，禽類胚胎是發(fā)生學(xué)研究比較熱門的材料，尤其胚體外的絨毛尿囊膜(Chorioallantoic membrane，CAM)血管網(wǎng)，經(jīng)常被作為研究對象[3-4]。在使用禽類胚胎的相關(guān)研究中，除最常用的雞胚外，日本鵪鶉也被大量研究人員所關(guān)注。對于日本鵪鶉的胚胎發(fā)育特征，已有一些研究做過描述。Padgett和Ivey(1960年)[5]描述了孵化每24 h節(jié)點時的鶉胚發(fā)育特征，并測量了胚胎完全伸展時的胚長、腿翅長度等數(shù)據(jù)。Ruffins等(2007年)[6]使用高分辨率核磁共振成像技術(shù)，再現(xiàn)了孵化第5～10胚日時日本鵪鶉胚胎在蛋殼內(nèi)的形態(tài)特征。Ruparelia等(2014年)[7]使用光學(xué)投影斷層掃描技術(shù)生成、建立了孵化1～15日齡的鶉胚3D模型圖譜門戶。Ainsworth等(2010年)[8]依據(jù)Hamburger和Hamilton(1951年)[9]所描述的雞胚發(fā)育的主要特征，也把日本鵪鶉胚胎發(fā)育相對應(yīng)劃分成46個時期，并與雞胚相應(yīng)特征的出現(xiàn)時間做了比較，同時還關(guān)注特定階段的羽毛色素沉積模式以及喙和第3腳趾的長度，來共同界定胚胎發(fā)育的時間。國內(nèi)張信文等(2002年)[10]報道了法國肉鵪鶉胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察。但是這些研究基本上都只關(guān)注胚胎本身的形態(tài)，而對于胚體外組織的形態(tài)變化沒有涉及。

普通日本鵪鶉蛋表面有不規(guī)則的色素沉積，難以實施“照蛋”工序以觀察孵化過程中其胚胎外組織在蛋殼上投影的變化，故未見有相關(guān)文獻報道。本試驗使用日本鵪鶉白殼蛋，在孵化中每天實施“照蛋”作業(yè)，觀察胚體外組織在蛋殼上的發(fā)展、分布變化，并解剖發(fā)育中胚蛋，觀察卵黃、卵白、胚胎和胚體外組織相對應(yīng)的形態(tài)特征變化。

1 材料與方法

試驗用日本鵪鶉為日本國立岐阜大學(xué)農(nóng)學(xué)部動物遺傳研究室所有，籠養(yǎng)于實驗禽養(yǎng)殖房，每籠養(yǎng)殖1公4母，每天給予16 h光照。給飼產(chǎn)蛋鶉專用飼料，自由采食和飲水。每天中午12：00取當天產(chǎn)受精蛋，在39 ℃、60%濕度條件下孵育，鈍端朝上傾斜45°，每2 h自動翻蛋1次(對側(cè)傾斜45°)。

每日12：00取出相應(yīng)孵化日齡的白殼胚蛋，在黑暗環(huán)境中，使用LED白光手電筒快速完成透照并拍照，然后放回孵化機繼續(xù)孵化。透照時，0～3胚日從蛋對側(cè)給光，4胚日以后為了拍照清晰，另在鈍端補光。同時取出解剖的各日齡胚蛋，置于平皿中解剖，2 h內(nèi)完成觀察。早期胚胎或某個關(guān)鍵細微位點使用解剖顯微鏡觀察，連接數(shù)碼相機拍照，較大胚胎直接用數(shù)碼相機拍照。拍照時平皿底部墊上直尺，以顯示拍攝對象的相對大小。

圖片使用Photoshop處理，根據(jù)直尺標定各個胚胎的相對大小。1～12胚日的形態(tài)學(xué)描述基于各1 000枚 以上鵪鶉胚蛋的解剖觀察，0胚日及13～15胚日的形態(tài)觀察以及照蛋各使用了5～10個樣本。為了更好理解并能與雞胚相比較，各鶉胚日齡后附有對應(yīng)的雞胚日齡數(shù)據(jù)參考Padgett和Ivey(1960年)[5]。

2 結(jié)果

0胚日(入孵前) 照蛋：除銳端稍微透亮外，其他區(qū)域呈均勻蛋黃色輪廓(圖1,0 d)。解剖：卵白完整包繞著卵黃。卵黃最上面白色圓盤狀區(qū)域為胚盤(圖2,0 d)。

1胚日(入孵24 h后) 照蛋：蛋鈍端浮現(xiàn)1個圓形血島，如同紅日，周圍亦被其染紅(圖1,1 d)。解剖：胚盤分化發(fā)育，黃豆大，突起于卵黃表面，為蛋黃胚胎區(qū)。由于還未形成完整卵黃循環(huán)，在透照時看到的紅色血島區(qū)域，解剖后觀察反倒不易看到紅色(圖2,1 d)。

2胚日(相當50～55 h雞胚) 照蛋：胚胎和血管組合成紅色“蚊蟲”外觀。卵黃投影靠近鈍端，血管網(wǎng)外緣圍成的櫻桃形或圓形輪廓，約占卵黃投影1/2，輪廓內(nèi)部還有1個由血管邊緣圍成的兩端大小不同的8字型輪廓，大端是胚胎的頭端，可見心臟在其中跳動(圖1,2 d)。解剖：卵黃循環(huán)形成。胚胎長條狀，藏于卵黃的凹陷內(nèi)。頭部扭轉(zhuǎn)、屈曲彎向胸側(cè)，抵近心臟。心臟扭曲管狀，節(jié)律性快速泵動。胚中段兩側(cè)有臍腸間動、靜脈延伸分布于卵黃囊，血管網(wǎng)向前后成放射狀分布，毛細血管在邊緣匯合成緣竇，緣竇圍成“櫻桃形”輪廓(圖2,2 d)。

3胚日(相當3～4 d雞胚) 照蛋：血管清晰，放射狀分布，與胚胎的心臟投影組合成“蜘蛛”外形。卵黃投影增大，血管區(qū)占卵黃投影的2/3以上?？梢?個V字形無血管區(qū)(圖1,3 d)。轉(zhuǎn)動胚蛋，胚胎及血管區(qū)域仍易游移。解剖：卵黃囊血管分布卵黃膜表面約1/3區(qū)域。卵黃囊血管向胚尾端生長的，開張幅度小，位于淺表，可見交織吻合在一起；而向頭端延伸的，開張范圍較大，且卵黃囊深陷，胚前端僅在邊沿見少量血管交織相連，故照蛋時呈V字形(圖2,3 d)。尿囊初現(xiàn)，呈球狀血管網(wǎng)，直徑約2 mm，比腦泡(頭突)略小；羊膜閉合成羊膜囊，包容胚體；上頜突變得明顯；眼睛仍無色素；胚體前部在心臟處向內(nèi)彎曲，小于90°，而胚胎后半部僅略微彎曲，但尾芽180°內(nèi)折，尾尖部抵向尿囊根部；四肢原基出現(xiàn)，翼芽的寬大于長，腿芽的長寬相近(圖3,3 d)。

4胚日(相當4.5～5 d雞胚) 照蛋：卵黃投影擴展到蛋的約下1/3界。血管網(wǎng)清晰，呈柵欄狀，占據(jù)蛋的中上大部分區(qū)域，但未完全覆蓋卵黃投影。在“血管柵欄網(wǎng)”的映襯下，4～6 d V字形缺口更明顯。此日開始，蛋轉(zhuǎn)動時，卵黃囊血管位移極慢，因其開始緊貼內(nèi)殼膜。鈍端接近氣室位置，有小區(qū)域變得明亮，是因羊水和尿囊液增多，此處透明度增加?；蝿优叩?，此處可見胚影或者黑色眼點閃現(xiàn)，俗稱“單珠”(圖1，4 d)。解剖：卵黃囊血管發(fā)展迅速，約占卵黃囊1/2表面，毛細血管微小，而主干血管走向清晰，“樹枝狀血管柵欄”外觀明顯。鮮紅的靜脈較粗，暗紅的動脈較細，易辨認。尿囊與羊膜囊近乎等大(圖2，4 d)。胚胎呈C字形，末端小尾芽內(nèi)構(gòu)，與兩側(cè)腿芽端部相鄰。胸腔未完全封閉，可見心臟突出于胸前。腿芽長大于寬，但其長度未超越尾尖。頭部腦包最明顯突起的是中腦。端腦兩葉突出，間腦消退。眼睛開始顯現(xiàn)色素(圖3,4 d)。

圖1 鵪鶉蛋孵化每間隔24 h的照蛋特征Fig.1 Candling quail eggs at 24 h intervals of incubation0 d～15 d：0～15日齡；下圖同。0～3 d：對側(cè)給光； 4～15 d：對側(cè)和鈍端雙光源0 d-15 d：0-15 day-old; the same as below. 0-3 d：Opposite light； 4-15 d：Lights from opposite side and blunt end

5胚日(相當6～6.5 d雞胚) 照蛋：上部明亮的尿囊區(qū)域迅速擴大，約占蛋1/6高度，較粗的尿囊膜血管緊貼于內(nèi)殼膜，清晰可見。卵黃囊“血管柵欄”占據(jù)了蛋中部1/3以上，已完全覆蓋卵黃投影，由于上部尿囊擠壓，其上端下移，“血管柵欄”高度收窄，且開始變得有些模糊或整體呈紅布帶樣(圖1,5 d)。解剖：卵黃囊血管延伸占據(jù)約3/5表面，毛細血管增粗、增多，主干血管彎曲增多，外觀呈樹狀分布特點。4～5 d卵黃囊體積膨脹至最大，之后漸縮小。漿膜從卵黃囊膜分離、游離的面積最大，且剩余與卵黃囊未分離的部分也極易剝離。尿囊生長顯著超過羊膜囊約3～4倍，游離于羊漿膜腔，包繞覆蓋羊膜囊，并與漿膜接觸融合形成CAM。尿囊血管增粗，分布稀疏，大部分四級分叉后以毛細血管相連(圖2，5 d)。中腦仍然非常大，其2個腦葉突出。端腦很大，但其雙葉狀態(tài)不如4 d時明顯。喙原基出現(xiàn)，尖端隱現(xiàn)白點。胚胎胸腹腔完全封閉，但透明，仍隱約可見心臟、肝、肌胃等內(nèi)臟。肘關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)明顯，肢端的3個指/趾分叉的輪廓也可分辨，腿的末端與尾尖平齊。胚胎增厚，尾芽呈背側(cè)彎曲而腹側(cè)平直的狀態(tài)(圖3，5 d)。

圖2 孵化各日齡胚蛋解剖后的外觀Fig.2 Appearance of embryo eggs after dissection at each day of incubation

6胚日(相當7.5 d雞胚) 照蛋：上部明亮尿囊區(qū)約占2/5高度，血管更粗更清晰，還能明顯看到分化的三級、四級血管，此后可以明顯看到一級血管隨著胚胎活動而晃動，胎兒在羊水中沉浮，時隱時現(xiàn)。尿囊生長延伸入漿膜和卵黃囊之間，可見CAM剛越過卵黃投影，開始接觸包繞卵白。CAM血管和卵黃囊血管重疊，因此，可見中部卵黃囊投影區(qū)“模糊血管柵欄”或“紅布帶”外觀，高度再收窄，約占1/5(圖1,6 d)。解剖：尿囊膜伸展，使?jié){膜從卵黃囊分離，并與漿膜粘合成CAM，包裹了卵黃囊，但還未完全越過卵黃囊。CAM血管層次清晰，見表面明顯的鮮紅色粗靜脈和暗紅色細動脈，進一步分化更多細血管，動靜脈間毛細管相連(圖2,6 d)。卵黃囊體積縮小，呈扁南瓜狀，血管延伸表面4/5區(qū)域，但卵黃囊血管區(qū)中心地帶，即上述V字形缺口，無血管區(qū)域顯著擴張，“南瓜”邊沿較多血管分布。移除壓迫的羊膜囊，“南瓜”柄部區(qū)域顯著突出，而邊沿呈輕微皺縮狀態(tài)(圖4A)。胚胎和5 d時相似，C字形，頭和身體近乎同大，啞鈴狀，但整體增大。中腦微突出于腦胞。卵齒較明顯。翅3指和腳4趾分界明顯。腿長1/3超出尾尖。尾巴短而鈍(圖3,6 d)。

圖3 孵化各日齡鶉胚的形態(tài)外觀Fig.3 Morphological appearance of quail embryos at each day of incubation3 d～6 d:3～6日齡，圖像放大3倍,比例尺=5 mm; 7 d～15 d:7～15日齡，比例尺=15 mm3 d-6 d:3-6 day-old，the image was magnified 3 times,scale bar=5 mm; 7 d-15 d:7-15 day-old，scale bar=15 mm

圖4 6胚日(A)和10胚日(B)的卵黃和卵白Fig.4 Yolk and white at day 6 (A) and day 10 (B) of incubation

7胚日(相當8～9 d雞胚) 照蛋：CAM生長全面越過卵黃囊血管區(qū)，大部包繞了蛋白，快接近蛋小端，準備吻合；CAM左右側(cè)前緣在胚蛋背面匯合成倒V字形狀，對應(yīng)位于漿尿囊膜二級血管分叉的下方。不易見到胚胎。卵黃囊可以晃動，故改變體位，其投影會稍微改變，但還不能轉(zhuǎn)動(圖1,7 d)。解剖：CAM毛細血管網(wǎng)更豐富，復(fù)雜。CAM主靜脈一邊(鮮紅粗血管)折向胚胎背側(cè)，動脈一邊向胚胎腹側(cè)伸展，CAM從胚胎腹、背、頭、尾側(cè)一起向蛋的銳端延伸，腹側(cè)伸展最快，牽引向銳端，背側(cè)最慢，所以照蛋時頭尾側(cè)尿囊邊沿在銳端背側(cè)形成倒V字型。卵黃囊有部分還緊貼于蛋殼膜，故照蛋時可以晃動而不能轉(zhuǎn)動。卵黃水分大量減少，卵黃囊皺縮成扁南瓜狀，邊沿皺褶加大，卵黃囊無血管區(qū)僅剩與卵白相鄰的直徑大約8 mm的區(qū)域，血管開始退化縮減(圖2,7 d)。胚胎鳥狀外觀基本形成。中腦不再突出。眼睛是頭部最突出的結(jié)構(gòu)，占頭部總面積的一半以上。眼瞼的周長略呈橢圓形，覆蓋眼睛的一部分。眼前角瞬膜出現(xiàn)。在虹膜周圍，14個鞏膜乳頭形成完整圓圈。耳道非常明顯。四肢大大加長，關(guān)節(jié)的彎曲均已完成，腿長的1/2超過尾尖。臂背到尾巴的背面開始有羽芽萌出跡象，腿根部紅色毛囊明顯可見。肝、胃、腸具雛形。膽囊還未見綠色膽汁(圖3,7 d)。

8胚日(相當10～11 d雞胚) 照蛋：上部清亮的尿囊區(qū)域還在擴大。CAM在銳端吻合，與蛋殼膜內(nèi)側(cè)完全緊貼，蛋白被完全包繞。CAM血管網(wǎng)完整覆蓋殼膜內(nèi)面。此時卵黃囊也可以隨胚胎轉(zhuǎn)動，胚胎在大范圍內(nèi)泳動，不時見胚胎的黑影閃動，尿囊一級血管明顯隨胚胎大范圍擺動(圖1,8 d)。解剖：CAM在蛋的小端合攏，包繞所有殼膜內(nèi)的內(nèi)容物。胚胎、卵黃、卵白從上到下層疊。卵黃囊血管多枯萎，血管遺跡處的卵黃囊呈現(xiàn)金黃色，與整體的黃顏色明顯區(qū)別(圖2,8 d)。喙突出，破殼齒較大。眼睛更加突出。眼瞼開始長滿眼球表面，橢圓形，下眼瞼向上生長，較上眼瞼平直。眼觀最明顯的是，黑和棕色羽芽初現(xiàn)。在腦后頸部兩側(cè)起向后延伸尾部、腰髂部背脊兩邊，前胸，翅根部、中翼和腿根等處的后緣，最早冒出羽芽。尾羽最長。露在臍外的小腸和連接卵黃囊的卵黃柄內(nèi)開始見到綠色膽汁，9 d仍可見。膽囊充盈膽汁(圖3,8 d)。

9胚日(相當12 d雞胚) 照蛋：上部尿囊明亮區(qū)域開始減小。胚胎黑影和黑色單眼或雙眼頻頻閃現(xiàn)。底部卵白一側(cè)被尿囊包裹提拉越過卵黃囊，抵近上部的尿囊清亮近透明區(qū)域，從胚蛋側(cè)面觀察，卵黃囊(黃紅色)投影近乎楔形插于蛋的中間。卵黃囊由于已經(jīng)被尿囊完全包裹而游離，反倒可以隨著胚胎的運動而游移，隨著胚蛋體位變化而發(fā)生一定程度的傾斜。8 d之前胚胎基本保持垂直于蛋的長軸的體位，9 d以后開始變換體位(圖1，9 d)。解剖：CAM循環(huán)已經(jīng)完整，正面可以看見上行分支的暗紅動脈和下行分支的鮮紅靜脈，卵黃囊區(qū)位置的尿囊血管多數(shù)呈垂直于大血管互生的小樹樣或長羽毛樣外觀。背側(cè)卵白囊的一端越過卵黃囊，接觸羊膜，漿羊膜道初形成，少量卵白已經(jīng)進入羊膜腔。剝離蛋殼膜時，CAM表面開始出現(xiàn)明顯出血，即毛細血管已伸入蛋殼內(nèi)膜纖維中(圖2，9 d)。喙更加突出，下喙先端也見白色角質(zhì)化，白色區(qū)域逐日擴大，到11 d最大，12 d開始變褐色。眼瞼橢圓形半閉，眼睛顯得略小；眼周見白色毛囊隆起。先前長出的羽芽黑色或棕色色素分明，翅根、中翅后沿、腿根部羽毛長可覆蓋相應(yīng)局部皮膚，頭部、頸部下方、耳廓前、眼眶下、翅背、腿背等處均冒出黑或褐色羽芽，頭部羽芽排列如同稀疏的“秧苗”(圖3，9 d)。

10胚日(相當12～13 d雞胚) 照蛋：尿囊明亮區(qū)繼續(xù)縮小。卵白囊被拉向羊膜，旋轉(zhuǎn)胚蛋可見卵黃囊和卵白呈互相嵌合。胚蛋中間，胚胎和卵黃的投影顯著擴大(圖1，10 d)。解剖：蛋殼與殼膜之間(剝離時感覺明顯)濕潤；CAM毛細血管更豐富，剝離殼膜出血點更密集(圖2，10 d)。羊膜腔多量稀卵白進入，剪破見明顯蛋白樣液體流出。卵黃囊血管極少，皺縮成“金元寶”狀，與橫臥的胚胎相擁，卵白囊墊于二者斜下方；卵白濃縮成圓饅頭狀凝塊，體積約為卵黃的1/3(圖4B)。眼瞼繼續(xù)生長，上下縮窄成新月形。除頸部兩側(cè)的小脊外，身體表面均長出羽毛。背面和側(cè)面羽毛棕和黑色，腹側(cè)的為白色或銀色。腳趾先端開始現(xiàn)白色角質(zhì)化(圖3，10 d)。

11胚日(相當13～14 d雞胚) 照蛋：中部胚胎和卵黃的黑影范圍繼續(xù)向大小端方向擴張。銳端卵白囊透光區(qū)縮小，僅半邊可見透明，不時見胚的尾部閃現(xiàn)(圖1，10 d)。解剖：在剝離殼膜時，CAM即出血，且感覺不易剝離，即血管侵入殼膜結(jié)合更緊密。尿囊腔內(nèi)見少量白色尿酸鹽沉淀，此后一直到15 d，尿酸鹽日增。卵白囊顯著減小，羊膜腔內(nèi)可見蛋白團塊。眼瞼羽毛明顯，開口近乎閉合(圖3，11 d)。10 d之后，肢體結(jié)構(gòu)沒有重大變化，只是大小變大，羽毛增長、增多。腿鱗片開始出現(xiàn)，逐日生長，明顯，重疊。除腿和喙，胚胎覆蓋各色羽毛。此后鶉胚羽毛增長變密，胚體無大的變化。

12胚日(相當15～16 d雞胚) 照蛋：黑影區(qū)域增大。尿囊血管的可見區(qū)域繼續(xù)變小。蛋銳端僅剩些微透光區(qū)域(圖1，12 d)。解剖：蛋殼與外殼膜結(jié)合區(qū)最為濕潤，蛋殼乳頭層如黏稠漿泥樣。外、內(nèi)殼膜之間，比內(nèi)殼膜與CAM之間更易于剝離，剝離外殼膜時，內(nèi)殼膜表面僅見一些點在出血，但剝離內(nèi)殼膜時，CAM表面密集出血(圖5A)。羊膜腔與羊漿膜道內(nèi)殘存少量絮狀卵白。

13胚日(相當17 d雞胚) 照蛋：銳端看不到光亮。因鶉胚變位下沉，上方尿囊血管明亮區(qū)反而變大(圖1，13 d)。解剖：氣室內(nèi)膜凹凸不平，可見起伏運動。蛋殼乳頭層與外膜間水分明顯減少。殼內(nèi)、外膜易分離。此日后殼內(nèi)膜與CAM逐日更易剝離，CAM表面僅見少量自限性出血(圖2，13 d)。卵黃囊團塊又開始變得松軟。

14胚日(相當17～18 d雞胚) 照蛋：黑影上端凹凸不平，明顯起伏變動(圖1，14 d)。解剖：CAM表面僅在與卵黃囊重疊區(qū)域，有少量出血點。羊膜與羊漿膜道的接口還在，為膜性柵網(wǎng)狀，羊膜腔剪破不再見蛋白樣液體擴散。小腸收進腹腔，牽扯卵黃囊緊貼于臍部，準備進入腹腔(圖2，14 d)。

15胚日(相當18～20 d雞胚) 照蛋：黑影再向鈍端擴張，氣室向一側(cè)傾斜，低側(cè)下緣可見CAM血管，其他黑色不透光。最特征的是喙竄破內(nèi)膜伸入氣室，氣室下緣蛋殼或已被喙頂破出現(xiàn)裂紋(圖1，15 d)。解剖：喙竄破內(nèi)殼膜伸入氣室空間。CAM血管退化剩少量；羊膜極薄(圖2，15 d)。蛋殼膜水分驟減，柔軟如紙張，剝離殼外膜后，殼內(nèi)膜顯示純白色(圖5B)，而此前由于有水分濕潤而顯近乎透明無色(圖5A)。尿囊腔還有少量尿液，白色尿酸鹽成片。卵黃已完全收入腹腔(圖3，15 d)。

圖5 孵化后期分層剝離蛋殼內(nèi)、外膜時的狀態(tài)Fig.5 Shows eggshell,outer membrane and inner membrane separable each otherA：12日齡; B：15日齡A:12 day-old; B:15 day-old

16胚日(相當21 d雞雛) 出殼。殼內(nèi)殘留尿酸鹽及尿囊血管遺存。

3 討論

本試驗展示了孵化中鶉胚及其胚體外組織發(fā)生、發(fā)展的形態(tài)和相對體位以及卵黃、卵白、蛋殼、殼膜的變化過程。

日本鵪鶉受精蛋孵化2 d，鶉胚呈長條形，心臟原基形成并搏動，開始血液循環(huán)；3 d羊膜閉合成囊包圍胚胎，胚腿翅原基出現(xiàn)，5 d胸腹腔封閉，3～6 d頭和軀干兩部分近乎等大同步漸增，呈C字形狀；7 d胚胎體軀腿翅伸長，鳥形初現(xiàn)，體表羽芽萌出，以后羽毛逐漸增多生長變密，并且軀體的生長快速超過頭頸部，后半期外觀主要是體軀增大，腿、爪、喙、羽毛等生長，變硬、變長、變大。

孵化中，卵黃囊體積逐日增大，4～5 d時達最大，以后漸小，15 d卵黃囊完全收入鶉胚腹腔。卵黃囊血管網(wǎng)2 d初現(xiàn)，如“蚊蟲”，浮游在蛋黃的頂面，因其還未粘附于蛋殼膜內(nèi)側(cè)面，血管觀感模糊；4～5 d最發(fā)達，在5 d以后尿囊生長楔入隔斷，血管逐漸開始枯萎、減少。

尿囊在3 d初現(xiàn)，為球形血管網(wǎng)，比頭泡略小。4 d約與羊膜囊同大。5 d開始與漿膜融合為CAM且生長楔入卵黃囊和殼內(nèi)膜之間，逐步取代卵黃囊血管網(wǎng)，與蛋殼外膜直接接觸，行使“呼吸”功能。6 d生長越過卵黃囊血管網(wǎng)。7 d到達蛋的銳端。8 d在銳端閉合，完整包繞了蛋殼膜之內(nèi)的胚胎、卵黃囊以及卵白囊。剝?nèi)サ皻つr，CAM血管9 d開始出現(xiàn)少量小出血點，以后逐日出血面增加，12 d時出血量達到高峰；這期間，蛋殼乳頭層水分漸增，12 d時水分最多，軟化成黏稠漿泥樣，說明9～12 d期間CAM毛細血管生長伸入蛋殼內(nèi)膜，水分滲透進入乳頭層，從而使輸送礦物質(zhì)成為可能，胚胎才能吸收鈣等礦物質(zhì)，為胚胎骨骼發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。13 d CAM血管開始逐漸枯萎，殼膜及乳頭層水分明顯減少，以后逐漸退出與殼膜的緊密連接。11 d尿囊腔中析出白色尿酸鹽，以后量逐日增加。

卵白量逐日減少，水分轉(zhuǎn)移進入卵黃囊[2]；8 d時被CAM包裹時形成的卵白囊包容，9 d可見卵白囊與羊膜間形成羊漿膜通道，卵白由此通道快速進入羊膜腔，供胚胎吞飲。

8 d膽囊綠色膽汁充盈，流到露在腹腔外的小腸以及卵黃柄的管道中，通向卵黃囊。此時膽汁可能開始參與了卵黃內(nèi)營養(yǎng)成分的消化。

禽蛋殼和殼膜不但共同組成蛋的堅固的保護結(jié)構(gòu)，也為胚胎后期發(fā)育提供主要的礦物質(zhì)來源[11-12]。蛋殼及殼膜的營養(yǎng)物質(zhì)吸收進入胚胎，其結(jié)構(gòu)解離、致弱，使胚胎容易破殼而出。這個過程，水分的參與必不可少。緊貼蛋殼膜內(nèi)側(cè)有個界限膜(Limiting membrane)，為勻質(zhì)、致密組織層，被認為是蛋保持水分的最主要結(jié)構(gòu),Yoshizaki和Saito(2002年)[13]發(fā)現(xiàn)，孵化中鶉胚蛋的界限膜逐日變薄，10 d達最薄，之后基本不變，而在8～12 d間殼膜的水分透過明顯逐日加快，之后穩(wěn)定。本課題組之前研究[14]發(fā)現(xiàn)，孵化5～10 d的鶉胚漿膜分泌一種蛋白酶，分解了界限膜，使之逐日變薄，讓水分得以較自由出入蛋殼膜和蛋殼乳頭層間的空間。這些發(fā)現(xiàn)與本試驗觀察到的12 d時蛋殼與殼膜接觸的乳頭層因含水分多而呈現(xiàn)石灰泥樣的現(xiàn)象基本吻合。另一研究[15]顯示，蛋殼內(nèi)、外膜相鄰的纖維并不完全平整，而是有一些互相糾纏扭結(jié)在一起，并在扭結(jié)處旁邊形成小空洞，同時內(nèi)外膜之間有多糖等成分填充的介在層黏結(jié)，這些結(jié)構(gòu)使得內(nèi)、外膜強力糾結(jié)、粘合在一起，不容易分離，加強了殼和膜整體的抗壓能力，以保護蛋內(nèi)容物及胚胎。孵化后期水分侵入蛋殼膜及殼、膜連接的乳頭層，溶解了其中多糖等可溶性基質(zhì)成分，軟化了殼膜纖維，原先扭結(jié)的纖維得以解離，同時溶解吸收了乳頭層的基質(zhì)及鈣等礦物質(zhì)，因此，內(nèi)、外殼膜之間以及殼與膜之間得以容易分離。這些變化使得蛋殼除氣室之外區(qū)域變得易碎，有助于雛鶉自行頂破蛋殼而孵出。

志謝：本試驗在日本國立岐阜大學(xué)完成。伊藤慎一教授、吉崎范夫教授提供鵪鶉蛋和試驗條件。并以此文紀念吉崎范夫教授。