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2022-01-18 06:45:50周謀林放李文丹孫宇單桂秋施琳穎
中國實(shí)用醫(yī)藥 2021年35期
周謀 林放 李文丹 孫宇 單桂秋 施琳穎
隨著二胎政策的放開,女性產(chǎn)后出現(xiàn)的一系列的問題逐漸受到了廣泛的關(guān)注。其中SUI 作為一種影響生活質(zhì)量的產(chǎn)后常見病,會給患者帶來嚴(yán)重的生理和心理影響［1］。SUI 主要的臨床表現(xiàn)為咳嗽、打噴嚏等腹壓突然增加時(shí),尿液不自主地流出。這種疾病雖然對生命不會造威脅,但給女性的身心健康以及生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重的影響［2,3］。外科手術(shù)是治療SUI 最有效也是最快捷的方式之一,但外科手術(shù)有其局限性,比如對固有尿道括約肌功能障礙的患者,手術(shù)就不是最有效的方法,而且操作時(shí)常會伴隨尿路感染、膀胱損傷、排尿功能障礙、發(fā)熱等手術(shù)并發(fā)癥,因此,使用注射療法治療SUI,成為了臨床醫(yī)生關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究通過建立大鼠壓力性尿失禁模型,并在大鼠尿道中段注射PRP 明膠微球,觀察其在壓力性尿失禁模型大鼠中的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雌性SD 大鼠32 只,體重為220～250 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK(粵)2011-0015。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。
1.1.2 主要設(shè)備 真空冷凍干燥機(jī)(廣州倍立思儀器有限公司,型號Alphal-4 LSC Plus)、生物安全柜(廣州市蘇泰空調(diào)凈化設(shè)備有限公司,型號AIRTECH)、水浴兩用振蕩器(上海悅豐上海悅豐儀器儀表有限公司,型號SH2B)、TCH 純水機(jī)(杭州天創(chuàng)凈水設(shè)備有限公司,型號TCH-RO/20)、磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司,型號DH-101S)、電子精密天平(德國Sartorius公司,型號BS124S)等。
1.1.3 主要材料 PRP(本研究團(tuán)隊(duì)自制)、固體明膠［西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司,G7041-500G,批號1002047083］；Span 80(天津恒興化學(xué)試劑廠,批號 20150107,化學(xué)純)、25%戊二醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號20150617,化學(xué)純)、異丙醇(廣州化學(xué)試劑廠,批號20150910-2,分析純)、丙酮(廣州化學(xué)試劑廠,批號20150209,分析純)、石油醚(天津市百世化工有限公司,批號GB/T 15894-2008,分析純)、液體石蠟(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司,批號141119,化學(xué)純)等。
1.2 方法
1.2.1 空白明膠微球制備
1.2.1.1 將3.0 g 固體明膠加入20 ml 的蒸餾水中,在50℃條件下攪拌溶解。完全溶解后,放置在50℃水浴箱中進(jìn)行孵育,待用。
1.2.1.2 將1.5 ml Span 80 加入100 ml 的液體石蠟中混勻。將50℃恒溫磁力加熱攪拌器轉(zhuǎn)速調(diào)為750～825 r/min 后,將上述混合物置于攪拌器中攪拌,并緩慢加入明膠溶液,乳化10 min。
1.2.1.3 乳化后快速將上述混合物轉(zhuǎn)入到冰水浴中,將溫度速降至4℃后,繼續(xù)攪拌15 min。
1.2.1.4 加入適量25%戊二醛預(yù)固化5 min,加入100 ml 25%戊二醛,4℃冰箱放置24 h。
1.2.1.5 24 h 后取出倒掉上清,加入100 ml 異丙醇脫水2 h。
1.2.1.6 按照丙酮、異丙醇、石油醚洗滌的順序,交替洗滌3 次,用真空抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾。將抽濾后的沉淀物放置于60℃干燥箱中干燥,即得到空白明膠微球。
1.2.2 PRP 明膠微球制備
1.2.2.1 將100 U/ml 凝血酶和100 mg/ml 的葡萄糖酸鈣溶液混合,制備成PRP 激活劑。
1.2.2.2 將凍存PRP 與血小板激活劑按體積比10∶1混合,置于37℃水浴箱中水浴30 min 后在220 g 條件下離心20 min,取上清即得到富血小板凝膠(PG)上清。
1.2.2.3 將100 μl PG 上清加至裝有10 mg 空白明膠微球的無菌EP管中,充分混勻后置于4℃冰箱浸潤24 h。
1.2.2.4 充分浸潤后,將EP 管置于-80℃超低溫冰箱中預(yù)凍過夜。
1.2.2.5 次日先將真空冷凍干燥機(jī)冷阱溫度降至-46℃,溫度達(dá)到后將EP 管移入真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空干燥(真空度＜133 mbar)24 h 后,隨后取出待用。使用時(shí)用生理鹽水按體積比1∶1 混合制成PRP 明膠微球溶液。
1.2.3 壓力性尿失禁大鼠模型的建立
1.2.3.1 SD 大鼠麻醉后,將不同型號的擴(kuò)張器依次插入大鼠陰道內(nèi),當(dāng)型號為34 F 的擴(kuò)張器能無阻力進(jìn)入大鼠的陰道后,取出擴(kuò)張器。在陰道內(nèi)插入末端為球囊的導(dǎo)管后,在陰道外口進(jìn)行縫合。
1.2.3.2 縫合完畢后,在球囊內(nèi)緩慢注射3 ml 的生理鹽水,使球囊一直屬于極度擴(kuò)張狀態(tài),并開始計(jì)時(shí)。見圖1。
圖1 大鼠陰道擴(kuò)張操作圖
1.2.3.3 擴(kuò)張4 h 后,將球囊內(nèi)的生理鹽水緩慢放出。待生理鹽水排空后,剪開陰道外口的縫線取出導(dǎo)管。
1.2.3.4 對SD 大鼠行噴嚏實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證壓力性尿失禁大鼠造模成功。
1.2.3.5 將32 只陰道擴(kuò)張大鼠隨機(jī)分為4組,每組8 只：A 組為假手術(shù)對照組(空白對照組)、B 組為生理鹽水組(對照組1)、C 組為空白明膠微球組(對照組2)、D 組為PRP 明膠微球組(實(shí)驗(yàn)組)。用剃毛器將下腹部皮膚的毛發(fā)剃光,使用無菌棉球進(jìn)行碘伏消毒后,用無菌刀片在下腹部行正中切口,切口長度約1 cm。依次切開皮膚、腹壁層后,暴露尿道和膀胱頸部。
1.2.3.6 假手術(shù)對照組切開下腹部暴露膀胱和尿道后,不注射任何物質(zhì)后,直接關(guān)閉腹壁。其余三組用微量注射器吸取各組溶液,分別于距膀胱0.5 cm 處的尿道近腹端3 點(diǎn)和9點(diǎn)的位置進(jìn)針,每一側(cè)都同時(shí)注射100 μl 各組溶液,進(jìn)針角度為30°,使局部隆起一小丘后留置針頭約5 s,再慢慢地拔出針頭。
1.2.3.7 手術(shù)后3、5、7、14、21 d 進(jìn)行HE 染色和Masson 染色。
1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組造模結(jié)果、HE 染色和Masson 染色結(jié)果。
2 結(jié)果
2.1 造模結(jié)果 32 只SD 大鼠噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性為28 只,成功率為 88%(28/32),4 只在噴嚏實(shí)驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)逼尿肌不穩(wěn)定性收縮。假手術(shù)對照組分配2 只噴嚏實(shí)驗(yàn)陰性大鼠、生理鹽水組、空白明膠微球組和PRP 明膠微球組各分配1 只。
2.2 HE 染色結(jié)果 由結(jié)果可知,A、B、C 組平滑肌排列稀疏,肌肉束的間隔增大；D 組平滑肌排列較整齊,肌肉束的間隔較致密。見圖2A-D。
2.3 Masson 染色結(jié)果 由結(jié)果可知,A、B、C 組可明顯地觀察到尿道外括約肌有廣泛的斷裂,肌肉排列紊亂；A、B 組無明顯膠原纖維(藍(lán)色)沉積,C 組可見膠原纖維沉積。D 組肌肉排列較完整,且膠原纖維沉淀明顯。見圖2E-H。
圖2 21 d 病理染色結(jié)果圖
3 討論
SUI 主要治療方式為保守治療和手術(shù)治療,但近年來,利用微創(chuàng)手術(shù)治療SUI 得到了快速發(fā)展,其中注射治療受到關(guān)注。有研究證明,注射單一生長因子可促進(jìn)體外培養(yǎng)的SUI 患者的肛提肌成肌細(xì)胞增殖［4］。
SUI 患者的盆底損傷、退化松弛或功能缺陷與膠原蛋白的代謝和異常有著密切的關(guān)聯(lián),膠原含量的降低,直接引起了盆底支持的組織彈性減弱,從而導(dǎo)致盆底松弛。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)作為盆底組織最重要的保護(hù)性因子之一,與膠原的合成、降解有著直接的關(guān)系。TGF-β1含量的高低,直接影響了基質(zhì)降解酶及其抑制因子的數(shù)量與活性,在盆底支持組織損傷的修復(fù)過程中,起著關(guān)鍵性的修復(fù)作用［5,6］。
PRP 是自體全血通過離心后獲得的高濃度血小板的血液制品,使用凝血酶和鈣離子共同激活后,可形成PG。該凝膠和其上清均可以釋放多種促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的生長因子,如轉(zhuǎn)化生長因子-β1、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等。這些生長因子有相互的協(xié)同作用,共同促進(jìn)著創(chuàng)面的修復(fù)和愈合［7,8］。PRP 在改善卵巢功能方面有著優(yōu)良的表現(xiàn),可有效增加子宮內(nèi)膜厚度［9］、恢復(fù)卵巢儲備功能［10］和調(diào)節(jié)性激素水平［11］,因此受到了婦產(chǎn)科醫(yī)生們的廣泛關(guān)注。明膠作為膠原的降解產(chǎn)物,是動(dòng)物的皮、骨等結(jié)締組織中膠原經(jīng)部分水解和熱變性而成的大分子蛋白質(zhì),其理化性能好,安全無毒且生物相容性好,已成為了控釋劑的理想載體［12］。有研究表明載IGF-1 的明膠微球,能有效促進(jìn)受損的尿道括約肌的恢復(fù)及血管再生,可明顯提高大鼠的尿控功能以及改善組織結(jié)構(gòu)［13,14］。為此,本課題組將PRP 和明膠微球聯(lián)合應(yīng)用,研制出了一種可緩釋多種生長因子的明膠微球。從病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,假手術(shù)對照組、生理鹽水組和空白明膠微球組可以看到尿道外括約肌損傷較嚴(yán)重,平滑肌排列稀疏,肌肉束的間隔增大,數(shù)量也相應(yīng)減少。而PRP 明膠微球組的尿道外括約肌的層數(shù)比其他組有明顯的恢復(fù),尿道外括約肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)也相對完整。
綜上所述,PRP 明膠微球除緩釋效果和安全性良好外,其促進(jìn)組織和細(xì)胞恢復(fù)的效果也較好,有望成為未來治療SUI 的一種新方法,下一步我們將繼續(xù)研究其使用的適應(yīng)證、最佳的注射劑量、部位及時(shí)間,為治療SUI 提供新思路。
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1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雌性SD 大鼠32 只,體重為220～250 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK(粵)2011-0015。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。
1.1.2 主要設(shè)備 真空冷凍干燥機(jī)(廣州倍立思儀器有限公司,型號Alphal-4 LSC Plus)、生物安全柜(廣州市蘇泰空調(diào)凈化設(shè)備有限公司,型號AIRTECH)、水浴兩用振蕩器(上海悅豐上海悅豐儀器儀表有限公司,型號SH2B)、TCH 純水機(jī)(杭州天創(chuàng)凈水設(shè)備有限公司,型號TCH-RO/20)、磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司,型號DH-101S)、電子精密天平(德國Sartorius公司,型號BS124S)等。
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1.2 方法
1.2.1 空白明膠微球制備
1.2.1.1 將3.0 g 固體明膠加入20 ml 的蒸餾水中,在50℃條件下攪拌溶解。完全溶解后,放置在50℃水浴箱中進(jìn)行孵育,待用。
1.2.1.2 將1.5 ml Span 80 加入100 ml 的液體石蠟中混勻。將50℃恒溫磁力加熱攪拌器轉(zhuǎn)速調(diào)為750～825 r/min 后,將上述混合物置于攪拌器中攪拌,并緩慢加入明膠溶液,乳化10 min。
1.2.1.3 乳化后快速將上述混合物轉(zhuǎn)入到冰水浴中,將溫度速降至4℃后,繼續(xù)攪拌15 min。
1.2.1.4 加入適量25%戊二醛預(yù)固化5 min,加入100 ml 25%戊二醛,4℃冰箱放置24 h。
1.2.1.5 24 h 后取出倒掉上清,加入100 ml 異丙醇脫水2 h。
1.2.1.6 按照丙酮、異丙醇、石油醚洗滌的順序,交替洗滌3 次,用真空抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾。將抽濾后的沉淀物放置于60℃干燥箱中干燥,即得到空白明膠微球。
1.2.2 PRP 明膠微球制備
1.2.2.1 將100 U/ml 凝血酶和100 mg/ml 的葡萄糖酸鈣溶液混合,制備成PRP 激活劑。
1.2.2.2 將凍存PRP 與血小板激活劑按體積比10∶1混合,置于37℃水浴箱中水浴30 min 后在220 g 條件下離心20 min,取上清即得到富血小板凝膠(PG)上清。
1.2.2.3 將100 μl PG 上清加至裝有10 mg 空白明膠微球的無菌EP管中,充分混勻后置于4℃冰箱浸潤24 h。
1.2.2.4 充分浸潤后,將EP 管置于-80℃超低溫冰箱中預(yù)凍過夜。
1.2.2.5 次日先將真空冷凍干燥機(jī)冷阱溫度降至-46℃,溫度達(dá)到后將EP 管移入真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空干燥(真空度＜133 mbar)24 h 后,隨后取出待用。使用時(shí)用生理鹽水按體積比1∶1 混合制成PRP 明膠微球溶液。
1.2.3 壓力性尿失禁大鼠模型的建立
1.2.3.1 SD 大鼠麻醉后,將不同型號的擴(kuò)張器依次插入大鼠陰道內(nèi),當(dāng)型號為34 F 的擴(kuò)張器能無阻力進(jìn)入大鼠的陰道后,取出擴(kuò)張器。在陰道內(nèi)插入末端為球囊的導(dǎo)管后,在陰道外口進(jìn)行縫合。
1.2.3.2 縫合完畢后,在球囊內(nèi)緩慢注射3 ml 的生理鹽水,使球囊一直屬于極度擴(kuò)張狀態(tài),并開始計(jì)時(shí)。見圖1。
圖1 大鼠陰道擴(kuò)張操作圖
1.2.3.3 擴(kuò)張4 h 后,將球囊內(nèi)的生理鹽水緩慢放出。待生理鹽水排空后,剪開陰道外口的縫線取出導(dǎo)管。
1.2.3.4 對SD 大鼠行噴嚏實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證壓力性尿失禁大鼠造模成功。
1.2.3.5 將32 只陰道擴(kuò)張大鼠隨機(jī)分為4組,每組8 只：A 組為假手術(shù)對照組(空白對照組)、B 組為生理鹽水組(對照組1)、C 組為空白明膠微球組(對照組2)、D 組為PRP 明膠微球組(實(shí)驗(yàn)組)。用剃毛器將下腹部皮膚的毛發(fā)剃光,使用無菌棉球進(jìn)行碘伏消毒后,用無菌刀片在下腹部行正中切口,切口長度約1 cm。依次切開皮膚、腹壁層后,暴露尿道和膀胱頸部。
1.2.3.6 假手術(shù)對照組切開下腹部暴露膀胱和尿道后,不注射任何物質(zhì)后,直接關(guān)閉腹壁。其余三組用微量注射器吸取各組溶液,分別于距膀胱0.5 cm 處的尿道近腹端3 點(diǎn)和9點(diǎn)的位置進(jìn)針,每一側(cè)都同時(shí)注射100 μl 各組溶液,進(jìn)針角度為30°,使局部隆起一小丘后留置針頭約5 s,再慢慢地拔出針頭。
1.2.3.7 手術(shù)后3、5、7、14、21 d 進(jìn)行HE 染色和Masson 染色。
1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組造模結(jié)果、HE 染色和Masson 染色結(jié)果。
2 結(jié)果
2.1 造模結(jié)果 32 只SD 大鼠噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性為28 只,成功率為 88%(28/32),4 只在噴嚏實(shí)驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)逼尿肌不穩(wěn)定性收縮。假手術(shù)對照組分配2 只噴嚏實(shí)驗(yàn)陰性大鼠、生理鹽水組、空白明膠微球組和PRP 明膠微球組各分配1 只。
2.2 HE 染色結(jié)果 由結(jié)果可知,A、B、C 組平滑肌排列稀疏,肌肉束的間隔增大；D 組平滑肌排列較整齊,肌肉束的間隔較致密。見圖2A-D。
2.3 Masson 染色結(jié)果 由結(jié)果可知,A、B、C 組可明顯地觀察到尿道外括約肌有廣泛的斷裂,肌肉排列紊亂；A、B 組無明顯膠原纖維(藍(lán)色)沉積,C 組可見膠原纖維沉積。D 組肌肉排列較完整,且膠原纖維沉淀明顯。見圖2E-H。
圖2 21 d 病理染色結(jié)果圖
3 討論
SUI 主要治療方式為保守治療和手術(shù)治療,但近年來,利用微創(chuàng)手術(shù)治療SUI 得到了快速發(fā)展,其中注射治療受到關(guān)注。有研究證明,注射單一生長因子可促進(jìn)體外培養(yǎng)的SUI 患者的肛提肌成肌細(xì)胞增殖［4］。
SUI 患者的盆底損傷、退化松弛或功能缺陷與膠原蛋白的代謝和異常有著密切的關(guān)聯(lián),膠原含量的降低,直接引起了盆底支持的組織彈性減弱,從而導(dǎo)致盆底松弛。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)作為盆底組織最重要的保護(hù)性因子之一,與膠原的合成、降解有著直接的關(guān)系。TGF-β1含量的高低,直接影響了基質(zhì)降解酶及其抑制因子的數(shù)量與活性,在盆底支持組織損傷的修復(fù)過程中,起著關(guān)鍵性的修復(fù)作用［5,6］。
PRP 是自體全血通過離心后獲得的高濃度血小板的血液制品,使用凝血酶和鈣離子共同激活后,可形成PG。該凝膠和其上清均可以釋放多種促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的生長因子,如轉(zhuǎn)化生長因子-β1、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等。這些生長因子有相互的協(xié)同作用,共同促進(jìn)著創(chuàng)面的修復(fù)和愈合［7,8］。PRP 在改善卵巢功能方面有著優(yōu)良的表現(xiàn),可有效增加子宮內(nèi)膜厚度［9］、恢復(fù)卵巢儲備功能［10］和調(diào)節(jié)性激素水平［11］,因此受到了婦產(chǎn)科醫(yī)生們的廣泛關(guān)注。明膠作為膠原的降解產(chǎn)物,是動(dòng)物的皮、骨等結(jié)締組織中膠原經(jīng)部分水解和熱變性而成的大分子蛋白質(zhì),其理化性能好,安全無毒且生物相容性好,已成為了控釋劑的理想載體［12］。有研究表明載IGF-1 的明膠微球,能有效促進(jìn)受損的尿道括約肌的恢復(fù)及血管再生,可明顯提高大鼠的尿控功能以及改善組織結(jié)構(gòu)［13,14］。為此,本課題組將PRP 和明膠微球聯(lián)合應(yīng)用,研制出了一種可緩釋多種生長因子的明膠微球。從病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,假手術(shù)對照組、生理鹽水組和空白明膠微球組可以看到尿道外括約肌損傷較嚴(yán)重,平滑肌排列稀疏,肌肉束的間隔增大,數(shù)量也相應(yīng)減少。而PRP 明膠微球組的尿道外括約肌的層數(shù)比其他組有明顯的恢復(fù),尿道外括約肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)也相對完整。
綜上所述,PRP 明膠微球除緩釋效果和安全性良好外,其促進(jìn)組織和細(xì)胞恢復(fù)的效果也較好,有望成為未來治療SUI 的一種新方法,下一步我們將繼續(xù)研究其使用的適應(yīng)證、最佳的注射劑量、部位及時(shí)間,為治療SUI 提供新思路。
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