克氏原螯蝦爛尾病病原的分離鑒定及其相關特性分析

劉張淮，吳 霆，王家軍，朱春艷，張熒熒，孟慶國

( 1.寶應縣水生動物疫病預防控制中心，江蘇 揚州 225800； 2.南京師范大學 海洋科學與工程學院，江蘇省水生甲殼動物病害重點實驗室，江蘇 南京 210023 )

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱螯蝦、龍蝦、淡水小龍蝦，屬甲殼綱、十足目、螯蝦科、原螯蝦屬，主要分布于我國江蘇、浙江、安徽、湖北、湖南等十余個省市地區(qū)，現(xiàn)已成為我國養(yǎng)殖范圍最廣的淡水螯蝦品種[1]。然而隨著我國克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖業(yè)興起，相關病害的發(fā)生也越來越普遍，主要包括真菌性、細菌性、病毒性和寄生蟲類疾病。已報道的克氏原螯蝦常見病原主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[2]、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[3-4]、擬態(tài)弧菌(V.mimicus)[5]、螺原體(Spiroplasma)[6-7]和白斑綜合征病毒[8]等。

克氏原螯蝦爛尾病是一種細菌性疾病，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中也時有發(fā)生，主要病因是由于機械損傷、互相打斗殘食或被幾丁質分解類細菌感染引起，但病原菌種類未有定論。在爛尾病發(fā)病早期，患病蝦出現(xiàn)尾扇邊緣發(fā)紅、水泡、潰爛、壞死等癥狀，高溫季節(jié)嚴重感染時可引起病蝦整個尾部潰爛甚至死亡?？耸显r細菌性疾病的病原菌種類繁多，其相關研究也十分廣泛，但關于早春季節(jié)克氏原螯蝦爛尾病的病原研究鮮有報道。2020年4月，江蘇省揚州市某養(yǎng)殖場克氏原螯蝦出現(xiàn)爛尾癥狀，病蝦尾扇部位出現(xiàn)肉質腫脹和灼燒狀疤痕，病蝦正常攝食，除尾扇邊緣潰爛外，體表和內(nèi)臟均無明顯病變，經(jīng)光學顯微鏡觀察和PCR檢測排除真菌、寄生蟲和病毒病原。為防止該病原繼續(xù)發(fā)展產(chǎn)生更大危害，筆者采集病蝦樣本并開展相關研究，為克氏原螯蝦疾病預防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病克氏原螯蝦取自江蘇省揚州市某養(yǎng)殖場，共計4尾鮮活病蝦，平均體質量約20 g。健康克氏原螯蝦購自揚州市寶應縣某養(yǎng)殖場，平均體質量(20±1) g。

1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購于南京便診生物技術有限公司；TaKaRa MiniBEST通用基因組DNA提取試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；革蘭氏染色試劑盒購于Solarbio公司；動物用藥敏分析試劑板購于南京菲恩醫(yī)療科技有限公司；PCR相關試劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR引物也由該公司合成。

1.3 細菌分離

取活體病蝦4尾，用無菌接種針蘸取尾部病灶組織于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取優(yōu)勢菌落于營養(yǎng)瓊脂平板上多次分離純化，得到2株代表菌株。同時將單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中增菌24 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 感染試驗

將健康克氏原螯蝦分成2個試驗組，分別感染2株分離菌。每個試驗組分設5個小組，包括3個感染組和2個對照組，每組設3個平行，每個平行投放8尾蝦。3個感染組分別加入1×107、1×108、1×109cfu/mL密度菌懸液各5 mL，并使用無菌剪刀剪除部分尾扇；對照組1加菌液不剪尾扇，菌液密度1×109cfu/mL，對照組2不加菌液剪尾扇。試驗中正常投喂飼料，每個養(yǎng)殖桶加水20 L，日換水1/4，試驗結束后對發(fā)病蝦尾扇感染部位進行細菌再分離。

1.5 細菌鑒定

1.5.1 細菌形態(tài)和生理生化特性

觀察培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)，并對純化培養(yǎng)的病原菌進行革蘭氏染色，置于1000倍光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)特征。同時測定病原菌蔗糖、半乳糖、尿素、精氨酸、賴氨酸等生理生化指標。

1.5.2 16S rRNA和gyrB基因測序分析

取純化培養(yǎng)的新鮮菌液，按照試劑盒操作說明分別提取2種細菌的DNA，用細菌通用引物序列F：5′-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3′和R：5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′[9]對菌株16S rRNA基因進行PCR擴增；gyrB基因引物序列為F：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGN GGNAARTTYGA-3′和R：5′-AGCAGGGTACG GATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTC AT-3′[10]。反應體系(25 μL)：上下游引物各0.1 μL，模板2 μL，預混液12.5 μL，無菌雙蒸水補齊。PCR反應條件：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。16S rRNA和gyrB基因擴增產(chǎn)物一部分進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，另一部分送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5.3 構建gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹

將分離菌的gyrB基因序列提交BLAST檢索系統(tǒng)比對，選擇相似度較高的菌株基因序列，使用MEGA 7軟件鄰接法構建gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(自展1000次)。

1.6 細菌相關特性分析

1.6.1 定居因子CFA基因檢測

DNA提取方法相同，定居因子CFA基因引物序列為F：5′-TCCAGCGCATTCA-3′和R：5′-TC CAGCCTTCGGCAAACG-3′[11]，退火溫度60.5 ℃，反應體系和條件參照1.5.2中16S rRNA和gyrB基因擴增。

1.6.2 幾丁質酶chi基因檢測

DNA提取方法相同，幾丁質酶chi基因引物序列為F：5′-CCAGGCGCCGTGGARRTCRTANSW CA-3′和R：5′-CGTGGACATCGACTGGGARTW YCC-3′[12]，退火溫度63 ℃，反應體系和條件參照1.5.2。

1.6.3 藥物敏感性檢測

試驗使用藥敏分析試劑板，對恩諾沙星、硫酸新霉素和甲砜霉素等8種常見抗菌藥進行藥物敏感性分析，篩選有效抗菌藥物。參照微量二倍稀釋法測定藥物最低抑菌質量濃度，藥敏試驗結果判定參照文獻[13]。

2 結 果

2.1 細菌分離

自患病克氏原螯蝦病灶部位(圖1a)分離出2株具有不同形狀和色澤的代表菌株，分別編號為LW2047-1和LW2047-2。

圖1 病蝦及死亡蝦癥狀Fig.1 Symptoms of diseased and dead red swamp crayfisha.采集病樣病灶部位; b.感染組蝦尾灼燒狀疤痕; c.感染組蝦尾潰爛; d.感染組蝦尾肉質囊腫; e.對照組1蝦尾灼燒狀疤痕; f.高密度組死亡蝦癥狀; 箭頭表示病灶.a.infection focus of the diseased crayfish sample collected; b.cauterization scar on crayfish tail in infected group; c.rotted part on crayfish tail in infected group; d.fleshy cyst on crayfish tail in infected group; e.cauterization scar on crayfish tail in control group; f.symptoms of dead crayfish in high density group; Arrow shows infection focus.

2.2 人工感染試驗

2.2.1 人工感染發(fā)病情況

人工感染后飼養(yǎng)10 d，菌株LW2047-1的感染組和對照組均無爛尾癥狀，高密度感染組出現(xiàn)少量死亡，死亡個體無爛尾癥狀。菌株LW2047-2各密度感染組均出現(xiàn)爛尾癥狀，平均發(fā)病率分別為70.8%、54.2%和45.8%，對照組1的平均發(fā)病率為25%，對照組2未出現(xiàn)爛尾癥狀(表1)。

表1 人工感染試驗的發(fā)病情況Tab.1 Morbidity in artificial infection test

2.2.2 病蝦及死亡蝦癥狀

在飼養(yǎng)過程中，菌株LW2047-2感染組病蝦癥狀與采集的病蝦樣癥狀相似，病蝦可以正常攝食，早期尾扇剪切部位出現(xiàn)潰爛和肉質囊腫，后期結痂形成灼燒狀疤痕(圖1b～d)。在未剪切尾扇的對照組1中同樣有小部分蝦產(chǎn)生尾部潰爛癥狀，癥狀相對較輕(圖1e)。在高密度組中有多尾蝦嚴重感染后死亡，在死亡蝦尾扇、肝胰腺、鰓和肌肉等組織中均能分離出該種細菌，死亡個體肝胰腺顏色正常，但有蛻殼未遂癥狀(圖1f)。感染試驗結束后，從感染組病蝦尾部再次分離到與菌株LW2047-2特征相同的菌株。試驗結果表明，克氏原螯蝦爛尾病病原為菌株LW2047-2。

2.3 細菌鑒定

2.3.1 菌落及細菌形態(tài)

分離菌株LW2047-2的菌落為圓形，乳白色，邊緣薄，直徑為1～2 mm，油亮反光(圖2a)。該菌為革蘭氏陰性菌，短桿狀，兩邊鈍圓，分散排列，偶爾出現(xiàn)菌體黏結成長條狀，以單個菌體或多個菌體聚集成團居多(圖2b)。

圖2 菌株LW2047-2的菌落和細菌形態(tài)Fig. 2 Colony and bacterial morphology of strain LW2047-2a.菌落形態(tài); b.細菌形態(tài)(1000×).a.colony morphology; b.bacterial morphology (1000×).

2.3.2 生理生化特性

生化鑒定結果顯示，菌株LW2047-2各項理化指標符合檸檬酸桿菌(Citrobacter)特性。與《水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原細菌學》[14]相關數(shù)據(jù)相比，除部分測定項目無數(shù)據(jù)外，其余結果均一致(表2)。

表2 菌株LW2047-2的生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain LW2047-2

2.3.3 16S rRNA基因序列分析

菌株LW2047-2的16S rRNA基因經(jīng)測序后，得到長度為495 bp的有效序列，將基因序列提交BLAST比對，結果顯示，該菌株16S rRNA基因與弗氏檸檬酸桿菌I-M-5-3、CX-100和78B-3相似性最高，達到99.35%，但與檸檬酸桿菌屬其他幾種菌株的相似性也較高(>98.91%)(表3)。

表3 菌株LW2047-2的16S rRNA基因序列比對結果Tab.3 Result of 16S rRNA gene sequence alignment of LW2047-2

2.3.4 gyrB基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

菌株LW2047-2的gyrB基因經(jīng)測序后，得到長度為1144 bp的有效序列。選擇嗜水氣單胞菌作為外群模式菌，構建gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結果顯示，菌株LW2047-2與一株弗氏檸檬酸桿菌歸為一支。

圖3 gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of gyrB gene

2.4 細菌相關特性分析

2.4.1 定居因子CFA基因檢測

CFA基因引物擴增出約100 bp的清晰條帶，陰性對照為無菌水(圖4a)。檢測結果表明，弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2具有定居因子基因CFA，可以表達產(chǎn)生毒力因子黏附素。

2.4.2 幾丁質酶chi基因檢測

chi基因引物擴增出的條帶大小約為250 bp，引物特異性好，無雜帶，條帶大小與目的片段一致，陰性對照為無菌水(圖4b)。檢測結果表明，弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2具有幾丁質酶基因chi，可以表達產(chǎn)生幾丁質酶。

圖4 CFA基因和chi基因序列擴增結果Fig.4 PCR amplification of CFA gene and chi genea.CFA基因擴增; b.chi基因擴增; M.DL2000 DNA Maker; 1.弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2擴增產(chǎn)物; 2.無菌水.a.Amplification of CFA gene; b.Amplification of chi gene; M.DL2000 DNA Maker; 1.PCR product of C. freundii LW2047-2; 2.Sterile water

2.4.3 藥物敏感性檢測

利用藥敏分析試劑板測定弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2的藥物敏感性(表4)。結果表明，該菌株對恩諾沙星和硫酸新霉素高度敏感，對磺胺類藥物不敏感，對氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素中度敏感。

表4 弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2的藥物敏感性Tab.4 Antimicrobial sensitivity of C. freundii LW2047-2

3 討 論

3.1 弗氏檸檬酸桿菌的免疫學特性

弗氏檸檬酸桿菌屬腸桿菌科，菌體呈桿狀，半透明或不透明，表面有光澤，邊緣不整齊，不產(chǎn)生吲哚，是一種革蘭氏陰性、氧化酶陰性的發(fā)酵產(chǎn)氣桿菌。該菌為條件致病菌，需氧或兼性厭氧，在光學顯微鏡下多為單個或雙個散狀排列，電鏡下可見其鞭毛，無芽孢和莢膜[14-15]。弗氏檸檬酸桿菌作為一種水產(chǎn)動物常見病原菌廣泛存在于自然環(huán)境中，如土壤、水、污水及食物等，是一種監(jiān)測水體污染的重要細菌學指標[16]。本試驗表明，克氏原螯蝦爛尾病病原為弗氏檸檬酸桿菌，關于該菌的研究較為常見，但鮮見其引發(fā)克氏原螯蝦爛尾病的報道。

弗氏檸檬酸桿菌的毒力因子主要包括溶血素、內(nèi)毒素、蛋白水解酶、幾丁質酶和黏附素[12,17-18]。筆者針對克氏原螯蝦作為甲殼動物具有幾丁質外殼的特征，結合該細菌感染尾扇后固定繁殖的特點，選取幾丁質酶和黏附素兩種毒力因子做深入研究。黏附素又稱定居因子，Minkara等[19]研究發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌可通過尿素酶分解尿素，在腸道黏膜表面附著固定以對抗惡劣的外界環(huán)境，尿素酶便是一種重要的黏附素；肖寧等[18]檢測了一株克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌的細胞黏附性，發(fā)現(xiàn)該菌可黏附于鯉(Cyprinuscarpio)上皮瘤細胞(EPC)周圍，并逐漸產(chǎn)生致病性，最終使細胞死亡；閻斌倫等[20]對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)源弗氏檸檬酸桿菌的定居因子抗原基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)該菌具有定居因子抗原CFA基因。本試驗中，同樣擴增出弗氏檸檬酸桿菌LW-2047-2的CFA基因，片段大小約100 bp，證明該菌株很可能具有黏附在受損組織或細胞周圍的特性，能在傷口處固定繁殖，形成囊腫或潰爛。除了黏附素，另一種毒力因子為幾丁質酶，關于弗氏檸檬酸桿菌分泌幾丁質酶的研究報道較少，Xu等[12]自大黃魚(Larimichthyscrocea)腸道中分離出一株可分解幾丁質的弗氏檸檬酸桿菌，并克隆了該菌的幾丁質酶chi-X基因，最終在大腸桿菌中成功表達，表達蛋白可分解膠體幾丁質。本試驗中，同樣在弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2中檢測出幾丁質酶chi基因，證明弗氏檸檬酸桿菌能產(chǎn)生幾丁質酶，腐蝕克氏原螯蝦幾丁質外殼。在人工感染試驗中，對照組中尾扇完整的蝦同樣發(fā)生輕度尾扇潰爛，這可能與該菌分泌幾丁質酶的特性有關。

3.2 弗氏檸檬酸桿菌的致病性

弗氏檸檬酸桿菌作為人類腸道中的正常菌群，是一種兼性厭氧的條件致病菌。Barnes等[21]最早于1946年報道該菌與人的腹瀉有關。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，由弗氏檸檬酸桿菌引起的水生動物病害報道越來越多。如2012年，弗氏檸檬酸桿菌引起安徽省全椒縣兩家稻田養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的克氏原螯蝦暴發(fā)性死亡[22]；2016年，柳州市柳城縣一家養(yǎng)殖場羅非魚大量死亡，經(jīng)鑒定后確定病原菌為弗氏檸檬酸桿菌[23]；同樣在2016年，安徽省當涂縣河道攔網(wǎng)養(yǎng)殖克氏原螯蝦大量發(fā)病死亡，病原菌為弗氏檸檬酸桿菌[18]。

弗氏檸檬酸桿菌作為魚類病原菌最早被報道于1982年，Sato等[24]研究發(fā)現(xiàn)，該菌為日本水族箱中翻車鲀(Molamola)的病原菌，病魚表現(xiàn)出體表出血、腐爛，并伴有脾臟紅腫、肝臟色淡和腸炎等癥狀；Sanz等[25-26]分別報道該菌與虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的病害有關，可引起魚體體表潰爛、肝臟發(fā)白和脾臟發(fā)黑等癥狀，同時影響腸胃系統(tǒng)。弗氏檸檬酸桿菌作為甲殼動物病原菌也有報道，肖寧等[18]從患病克氏原螯蝦肝胰腺中分離出一株弗氏檸檬酸桿菌，該菌引起克氏原螯蝦肌肉腫脹，同時導致心臟出現(xiàn)色素沉著，肝胰腺顏色變深；沈錦玉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌可引起紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)死亡，死蝦尾部腫脹，并結有疤痕，這與本試驗中克氏原螯蝦爛尾癥狀十分相似；閻斌倫等[20]自病死三疣梭子蟹體內(nèi)分離出一株弗氏檸檬酸桿菌，該菌可引起蟹體肌肉糜爛、肝胰腺和肌肉組織水腫；黃曉東等[28]通過回感試驗，發(fā)現(xiàn)弗氏檸檬酸桿菌會引起中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)黑鰓和肝胰腺呈淺黃色癥狀。克氏原螯蝦具有與上述甲殼動物相似的生理結構和相近的種屬關系，但與上述研究結果不同的是，在本次人工感染試驗中，高密度組病死蝦的肝胰腺并未出現(xiàn)褪色或顏色加深，說明在早春季節(jié)，水溫較低、溶解氧條件較好時，該菌致病性較弱，主要影響甲殼受損的蝦，造成體表潰爛等癥狀，后期致病性可能受環(huán)境和溫度影響增強，引起蝦體內(nèi)臟病變和死亡。此外，弗氏檸檬酸桿菌還可侵染蛙、鱉和貝類等[29-31]多種水生動物。

3.3 弗氏檸檬酸桿菌的藥物敏感性

在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，抗菌藥物可直接殺滅細菌，達到防病治病的效果，而不同細菌的藥物敏感度各不相同。因此，分析病原菌的藥物敏感性對疾病防控和養(yǎng)殖生產(chǎn)指導具有重要意義。陳紅蓮等[22]檢測出克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌對7種喹諾酮類、5種氨基糖苷類藥物和頭孢他啶敏感，對5種抗菌藥物具有耐藥性；沈錦玉等[27]分離出的紅螯螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌L1和L2對復方新諾明、丁胺卡那等7種抗菌藥物敏感；林啟存等[30]從中華鱉(Trionyxsinensis)中分離出的弗氏檸檬酸桿菌對復方新諾明和四環(huán)素耐藥，對慶大霉素、左旋氧氟沙星和丁胺卡那霉素等藥物敏感；萬彪等[32]從甌江彩鯉(Cyprinuscarpiovar.color)中分離的弗氏檸檬酸桿菌GZMT2013-CF對恩諾沙星、頭孢噻呋和慶大霉素等7種抗生素高度敏感，對磺胺類藥物具有抗性。本試驗的藥敏試驗結果顯示，弗氏檸檬酸桿菌LW-2047-2對恩諾沙星和硫酸新霉素敏感，這與黃曉東等[28]藥敏試驗結果相似，生產(chǎn)中可使用恩諾沙星和硫酸新霉素等藥物來減少此類疾病的發(fā)生。另一方面，弗氏檸檬酸桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)產(chǎn)生不同程度的耐藥性，養(yǎng)殖戶需靈活使用不同抗菌藥物，相關研發(fā)部門也應盡快研發(fā)如中草藥免疫制劑和可抑制病原菌毒力基因表達或阻斷毒素傳遞的新型藥物。

4 結 論

試驗結果表明，引發(fā)克氏原螯蝦爛尾病的病原為弗氏檸檬酸桿菌。該菌具有較強的致病性，不僅會侵蝕克氏原螯蝦的幾丁質外殼，造成尾部組織紅腫、潰爛，嚴重感染時還可能直接引起病蝦死亡。在養(yǎng)殖過程中，尤其需要注意弗氏檸檬酸桿菌在早春季節(jié)的潛在危害，提前做好防范措施，秉承“預防為主，防重于治”的疾病防治理念。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中可使用恩諾沙星和硫酸新霉素進行防治。