王 韜， 王志堯， 陳 飛， 常 霞， 馬艷妮， 姜 曉

（1.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，鄭州 450002； 2.河南省科學(xué)院河南納普生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002；3.鄭州云德生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002）

胡椒在中醫(yī)臨床上應(yīng)用有黑胡椒和白胡椒兩種形式，來源于植物胡椒（Piper nigrumLinn.）不同采收時期的果實，藥農(nóng)在其果實表面顏色由綠色逐漸變?yōu)榘稻G色時采收并經(jīng)曝曬干燥后，表面顏色進(jìn)一步加深，變?yōu)楹诤稚嗜藗兎Q之為黑胡椒. 又因黑胡椒表面具隆起網(wǎng)狀皺紋，又名黑川. 胡椒作為一種名貴藥材，最早僅在南印度一帶種植，目前我國兩廣、云南等多地也已經(jīng)引種成功并有大面積種植［1］. 黑胡椒是西式肉食餐飲制作過程中極為常用的調(diào)味料，制作牛排時更是必不可少［2］. 胡椒堿作為來源于黑胡椒重要的深加工產(chǎn)品也成為重要的食品添加劑之一［3］. 黑胡椒味辛、性溫，功效溫中散寒、下氣、消痰，是一味常用的中藥［4］，其中胡椒堿是黑胡椒最重要的活性成分［5］. 胡椒堿藥理作用廣泛，具有抗腫瘤［6］、抗氧化［7-9］、抗菌消炎［10-11］、神經(jīng)保護(hù)［12-14］、免疫調(diào)節(jié)［15］、抗驚厥［16-17］、殺蟲［18-19］等作用. 尤其在癌癥的治療方面，胡椒堿具有巨大的藥物開發(fā)潛力，可以抑制瘤體的生長，達(dá)到抗腫瘤的作用，其抗腫瘤作用可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡以及抑制血管生成［20-21］，但在體外實驗中胡椒堿類通常是在較高劑量發(fā)揮潛在的抗癌作用. 胡椒堿類還能提高姜黃素類的生物利用度，其機(jī)制可能是胡椒堿類能抑制了姜黃素的代謝酶活性，同時胡椒堿類還能與姜黃素類結(jié)構(gòu)上的羥基形成氫鍵，并穿過血腦屏障，使姜黃素類結(jié)合能夠產(chǎn)生神經(jīng)毒性引起阿茲海默病的淀粉樣蛋白，提高了姜黃素類的生物利用度，從而提升姜黃素類在血清中的濃度［22-23］. 但姜黃素、胡椒堿都有水溶性低、在生理條件下不穩(wěn)定、腸道吸收少、在體內(nèi)代謝迅速等特性，導(dǎo)致其在體內(nèi)易消除、生物利用度極低等現(xiàn)象，限制其臨床應(yīng)用.

雖然胡椒堿在黑胡椒和白胡椒均有發(fā)現(xiàn)，但在黑胡椒中的含量明顯高于白胡椒. 我們在進(jìn)行胡椒堿與姜黃素“基于共無定型固體分散技術(shù)的抗癌天然活性成分組增溶增效及其作用機(jī)制研究”時，需要大量的胡椒堿原料，在調(diào)研其制備方法時發(fā)現(xiàn)，提取天然來源的胡椒堿的現(xiàn)有工藝包括超臨界萃取法、酶解法、有機(jī)溶劑提取法、酸溶堿沉法等，普遍存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、設(shè)備成本高、毒性有機(jī)溶劑殘留、工業(yè)化生產(chǎn)器件安全性較難保證、環(huán)境不友好等問題. 而乙醇水溶液作為提取溶劑進(jìn)行熱回流提取，設(shè)備成本相對低，無需有毒有害試劑，綠色環(huán)保，但利用BOX-BEHNKEN設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化黑胡椒中的胡椒堿提取工藝參數(shù)還鮮見諸報道. 本研究優(yōu)化了從黑胡椒中獲得胡椒堿的工藝參數(shù)，比文獻(xiàn)報道利用乙醇熱回流提取方法從黑胡椒中獲取胡椒堿的含量高［24-25］，對從黑胡椒中獲得天然來源胡椒堿類成分具有一定的參考價值.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑胡椒：鄭州市參茸中藥材市場；胡椒堿：四川省維克奇生物科技有限公司（批號：20041710，純度99.71%）；甲醇：Fisher公司，色譜級；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司（型號：Agilent1260，DAD檢測器）；分析型色譜柱：美國安捷倫科技有限公司（型號：Agilent Eclipse Plus C18，規(guī)格250 mm×4.6 mm，5 μm）；萬分之一電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司（型號：ME204）；十萬分之一電子天平：日本島津（SHIMADZU）公司（型號：AUW220D）；高速萬能粉碎機(jī)：瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司（型號：111B）.

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液配制 精確稱取胡椒堿0.020 8 g，用無水乙醇定容至10 mL棕色容量瓶，即得.

1.3.2 樣品測定的液相色譜條件 流動相采用甲醇-水（體積比77∶23），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長λ=343 nm，進(jìn)樣量10 μL.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 將1.3.1 所得對照品溶液配制成1、2、20、40、100、200 mg/L 的溶液，按照1.3.2 色譜方法進(jìn)行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（橫坐標(biāo)為對照品溶液濃度，縱坐標(biāo)為胡椒堿色譜峰的峰面積），得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=55.352 5x+41.815 7（R2=0.998 9），表明在1～200 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

1.3.4 樣品的處理及胡椒堿得率的計算方法 黑胡椒粉末過4號篩，稱取2.00 g，用不同濃度的乙醇-水溶液為提取溶劑，進(jìn)行熱回流提取，合并濾液，減壓回收溶劑，所得浸膏轉(zhuǎn)移至50 mL的棕色容量瓶中，甲醇定容.取1 mL置棕色容量瓶，用甲醇定容至10 mL，取續(xù)濾液，按照1.3.2色譜條件進(jìn)行測定，并按以下公式計算胡椒堿得率.

1.3.5 單因素試驗 分別考察乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)和提取時間4個因素對胡椒堿得率的影響.

1.3.6 BOX-BEHNKEN實驗設(shè)計 根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素影響試驗結(jié)果，以乙醇濃度、料液比（g∶mL）、單次提取時間和提取次數(shù)為自變量，以胡椒堿提取得率為響應(yīng)值，試驗設(shè)計見表1.

表1 黑胡椒提取工藝BOX-BEHNKEN分析法實驗設(shè)計因素與水平Tab.1 Design factors and levels of BOX-BEHNKEN methodology for extraction of black pepper

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑中乙醇濃度對黑胡椒中胡椒堿得率的影響 當(dāng)提取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)≤80%時，胡椒堿得率隨乙醇濃度呈正相關(guān)；當(dāng)提取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)≥80%時，胡椒堿得率隨乙醇濃度呈負(fù)相關(guān)，如圖1 所示. 因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇80%左右為宜.

圖1 不同濃度提取溶劑對胡椒堿得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of piperine

2.1.2 料液比對黑胡椒中胡椒堿得率的影響 料液比對胡椒堿得率的影響見圖2，考慮到得率和成本，料液比選擇1∶12.5左右為宜.

圖2 料液比對胡椒堿得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of piperine

2.1.3 提取次數(shù)對黑胡椒中胡椒堿得率的影響 如圖3所示，提取3次以后胡椒堿得率幾乎不變，提取次數(shù)選擇3次左右為宜.

圖3 提取次數(shù)對胡椒堿得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on the extraction rate of piperine

2.1.4 提取時間對黑胡椒中胡椒堿得率的影響 如圖4 所示，當(dāng)提取時間超過3 h 后胡椒堿得率略有下降，因此，提取時間應(yīng)選擇3 h左右為宜.

圖4 單次提取時間對胡椒堿得率的影響Fig.4 Effect of single extraction time on the extraction rate of piperine

2.2 模型方差分析

對胡椒堿提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表2.

表2 試驗設(shè)計及其對應(yīng)的胡椒堿得率Tab.2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

綜合考慮單因素試驗結(jié)果，利用Design-expert 7.0.0統(tǒng)計軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到多元二次回歸方程模型：

式中：E為胡椒堿得率，%；A為乙醇濃度；B為料液比；C為提取次數(shù)，次；D為提取時間，min.

對該回歸方程進(jìn)行方差分析見表3，可以看出，回歸模型（P<0.000 1）顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.974 5，失擬項（P=0.231 8>0.05），表明失擬項相對于絕對誤差不顯著，因此，該模型對試驗的擬合程度良好，能較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用該模型對實驗參數(shù)進(jìn)行分析. 由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內(nèi)，本研究所考察的4 個因素對胡椒堿提取得率影響都有很大的影響，其相關(guān)性順序為：A>D>B>C. 二次項A2、B2、C2和D2影響極顯著，交互項AB、AD達(dá)到顯著水平，表明各因素對胡椒堿得率的影響不是簡單線性關(guān)系.

表3 方差分析結(jié)果表Tab.3 ANOVA of regression analysis

2.3 響應(yīng)面分析

乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）和提取時間（D）4個因素之間的交互作用對胡椒堿得率的影響，如圖5～10所示.

圖5 E=f（A，B）的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of E=f（A，B）

圖6 E=f（A，C）的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plot of E=f（A，C）

圖7 E=f（B，C）的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plot of E=f（B，C）

圖8 E=f（A，D）的響應(yīng)面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour plot of E=f（A，D）

圖9 E=f（B，D）的響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour plot of E=f（B，D）

分析圖5～圖10中響應(yīng)面可知，當(dāng)乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）和提取時間（D）取值較小時，效應(yīng)面曲線較陡，說明此時A、B、C、D對胡椒堿提取得率影響較為顯著，但A、B、C、D取值較大時，效應(yīng)面曲線較平緩，此時A、B、C、D對胡椒堿提取得率影響較小.

圖10 E=f（C，D）的響應(yīng)面及等高線圖Fig.10 Response surface and contour plot of E=f（C，D）

分析圖5～圖10等高線可知，當(dāng)A、B、C、D取值較小時，等高線密度大；當(dāng)A、B、C、D取值較大時，等高線密度較小，說明A、B、C、D取值小時，對胡椒堿提取得率影響較為顯著，與響應(yīng)面規(guī)律相同.

經(jīng)過BOX-BEHNKEN 設(shè)計優(yōu)化提取條件，得到最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)83.18%，料液比1∶10.93，提取次數(shù)3.22 次，提取時間2.46 h，此時胡椒堿提取得率理論值可達(dá)到5.39%. 在此最佳工藝條件下為參考，按照乙醇體積分?jǐn)?shù)83%，料液比1∶11，提取次數(shù)3次，提取時間2.5 h，在這樣的最優(yōu)參數(shù)下胡椒堿得率可達(dá)5.45%.

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用BOX-BEHNKEN 設(shè)計-效應(yīng)面法對黑胡椒中胡椒堿的提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化. 確定最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)83%，料液比1∶11，提取次數(shù)3 次，提取時間2.5 h. 胡椒堿得率預(yù)測值為5.46%，胡椒堿實際得率可達(dá)5.45%. BOX-BEHNKEN設(shè)計-效應(yīng)面模型擬合程度達(dá)99.81%，實驗誤差小，對黑胡椒中獲得天然來源胡椒堿類成分具有一定的參考價值.