退熱六法對(duì)脂多糖致熱兔toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB及炎癥因子的影響

焦誼 劉志鳳 于天源 張英琦 劉迪 王厚融 徐亞靜 官乾

發(fā)熱作為兒科常見(jiàn)的癥狀之一，發(fā)生率為25.7%，每人每年約0.8次[1]。長(zhǎng)期發(fā)熱或體溫過(guò)高則會(huì)損害機(jī)體調(diào)節(jié)功能，使病情惡化。小兒推拿退熱具有安全性和有效性[2]，其中以開(kāi)天門(mén)[3]138、推坎宮[3]138、揉太陽(yáng)[3]138-139、揉耳后高骨[3]151、清天河水[4]、推脊[5]手法最為常用，現(xiàn)有小兒推拿退熱研究不深入，受到社會(huì)質(zhì)疑。故選取脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)模型模擬臨床細(xì)菌性發(fā)熱，LPS作為toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)公認(rèn)的配體，能刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、感染、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化及凋亡等[6]，發(fā)熱過(guò)程以炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)最為重要，故以退熱六法為例，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)2月齡新西蘭幼兔24只，體質(zhì)量(2000±200)g，肛溫(39.00±0.50)℃，雌雄各半，購(gòu)自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心[合格證號(hào)為SCXK(京)2019-0006]。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度(25±0.5)℃，相對(duì)濕度(65±5)%，12小時(shí)/12小時(shí)明暗周期，自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，排除肛溫波動(dòng)大于0.4℃的新西蘭兔。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合動(dòng)物福利與倫理原則。

1.2 儀器及試劑

主要試劑：大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖(美國(guó)Sigma公司；批號(hào)：055：B5 L2880)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司；批號(hào)：PC0020)；TLR4抗體(批號(hào)：bs-20594R)、NF-κB p65抗體(批號(hào)：bs-0465R)、GAPDH抗體(批號(hào)：bsm-0978M)以上試劑均購(gòu)自北京奧博森生物科技有限公司。

主要儀器： ChemiDoc MP成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國(guó)THERMO公司)；BL-420N(成都泰盟軟件有限公司)、動(dòng)物五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀(優(yōu)利特URIT-5160Vet)。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備

將24只新西蘭兔隨機(jī)分為正常組8只、模型組8只、推拿組8只。清醒狀態(tài)下，模型組和推拿組幼兔耳緣靜脈注射濃度為0.5 μg/mL LPS，注射量為1 mL/kg[7-8]，注射后1小時(shí)內(nèi)肛溫上升超過(guò)0.6 ℃為造模成功，正常組不予處理。

1.4 干預(yù)方法

正常組和模型組正常飼養(yǎng)。推拿組：造模后1小時(shí)干預(yù)1次。(1)開(kāi)天門(mén)：定位：兩眉骨內(nèi)側(cè)中點(diǎn)至神庭穴(前正中線，額頂骨縫交界處)[9]，操作：用拇指自下而上交替直推200次，2分鐘[10]；(2)推坎宮：定位：精明穴(內(nèi)眼角，上下眼瞼交界處)直上至絲竹空穴(眶上突外端)[9]，操作：用兩拇指橈側(cè)自眉心向眉梢做分推200次，2分鐘[10]；(3)揉太陽(yáng)：定位：太陽(yáng)穴(外眼角后上方顳窩中)[9]，操作：用兩拇指橈側(cè)推運(yùn)200次，2分鐘[10]；(4)揉耳后高骨：定位：寰椎翼前緣直上方凹陷處[9]，操作：用兩拇指或中指端揉24次掐3下，2分鐘[10]；(5)推脊：定位：大椎穴(背中線上，第7頸椎與第1胸椎棘突間)至尾根[9]，操作：用食中二指自上而下直推300次，5分鐘[10]。(6)清天河水：定位：腕橫紋至肘橫紋[9]，操作：用食中指指面自腕推向肘，推500次，5分鐘[11]。操作要點(diǎn)：由推拿學(xué)科專(zhuān)業(yè)人員操作，且都為同一人干預(yù)，操作時(shí)蘸取與室溫相同的溫水。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 肛溫監(jiān)測(cè) 采用BL-420N監(jiān)測(cè)肛溫變化。肛溫探頭涂上適量石蠟油，插入肛門(mén)固定為5 cm，待穩(wěn)定后讀數(shù)，作為幼兔的肛溫，之后每隔30分鐘記錄一次肛溫，連續(xù)監(jiān)測(cè)6小時(shí)。體反應(yīng)指數(shù)(total response index,TRI)：按梯形法計(jì)算造模后2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)的曲線下面積(TRI2-6)，橫坐標(biāo)0.5小時(shí)為1 cm，縱坐標(biāo)0.5 ℃為1 cm。

1.5.2 中性粒細(xì)胞比率檢測(cè) 于造模前、造模后1小時(shí)、造模后3小時(shí)(即推拿后2小時(shí))耳緣靜脈采血，用EDTA抗凝管采取0.5 mL即可，抽取完畢后輕輕搖勻4～5次，避免凝血。在室溫保存2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)中性粒細(xì)胞比率(neutrophil granulocyte,NEU%)。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β含量 于造模后3小時(shí)(即推拿后2小時(shí))耳緣靜脈采血1 mL，置于紅色真空采血管中，室內(nèi)保存20分鐘內(nèi)進(jìn)行離心，4℃ 3000 rpm離心20分鐘，取上清置于EP管保存，按試劑盒方法測(cè)定血清中TNF-α、IL-1β含量。

1.5.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)肝、肺組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá) 于造模后3小時(shí)腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100g)，抽取腹主動(dòng)脈血，取出適量大小肝臟、肺臟組織100 mg，將組織放于組織裂解液中研磨，每10分鐘震蕩1次，共震蕩4次，混合液4℃、12000 rpm 離心20分鐘，吸取上清。BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加5×蛋白上樣緩沖液混勻，95℃變性5分鐘。配置8%分離膠和5%濃縮膠，上樣后穩(wěn)定電泳濃縮膠60 V、分離膠80 V，冰上電轉(zhuǎn)100 V 70分鐘，10%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，依據(jù)Maker裁膜，一抗(TLR4 1∶1000，NF-κB p65 1∶2000，GAPDH 1∶1000)室溫?fù)u床孵育1小時(shí)后4℃冰箱過(guò)夜。洗膜3次，孵育二抗(羊抗兔IgG 1∶10000，羊抗小鼠 IgG 1∶10000)，顯影液均勻滴在膜上，成像儀顯影，Image Lab圖像分析軟件分析目的條帶，定量分析各蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

注：A:開(kāi)天門(mén)；B：推坎宮；C：揉太陽(yáng)；D：揉耳后高骨；E：推脊；F：清天河水

2 結(jié)果

2.1 各組幼兔肛溫變化比較

基礎(chǔ)肛溫：正常組基礎(chǔ)肛溫與模型組、推拿組相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；造模后1小時(shí)(推拿前)：推拿組與模型組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，推拿組和模型組肛溫顯著高于正常組(P<0.05)；造模后2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)(即推拿后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí))：推拿組肛溫顯著低于模型組(P<0.05)；造模后5小時(shí)、6小時(shí)(即推拿后4小時(shí)、5小時(shí))：推拿組肛溫與模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 退熱六法對(duì)各組幼兔肛溫的影響

圖2 退熱六法對(duì)各組幼兔肛溫的影響

造模后3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)，推拿組體反應(yīng)指數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 退熱六法對(duì)各組幼兔體反應(yīng)指數(shù)的影響

2.2 各組幼兔中性粒細(xì)胞比率變化比較

造模后3小時(shí)，推拿組NEU%顯著低于模型組(P<0.05)；組內(nèi)比較，模型組造模后1小時(shí)、3小時(shí)的 NEU%高于造模前(P<0.05)，推拿組只有造模后1小時(shí)的 NEU%高于造模前(P<0.05)；推拿組造模3小時(shí) NEU%與造模前無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 退熱六法對(duì)各組幼兔外周血中性粒細(xì)胞比率表達(dá)的影響

2.3 退熱六法對(duì)發(fā)熱幼兔血清炎癥因子的影響

造模后3小時(shí)，模型組血清中TNF-α含量明顯高于正常組(P<0.05)，推拿組血清中TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05)；模型組血清中IL-1β含量高于正常組(P<0.05)，推拿組血清中IL-1β含量低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表 4。

表4 退熱六法對(duì)各組幼兔血清炎癥因子表達(dá)的影響

2.4 退熱六法對(duì)發(fā)熱幼兔肝、肺組織TLR4/NF-κB p65的影響

造模后3小時(shí)，推拿組和模型組肝、肺組織中TLR4、NF-κB p65表達(dá)高于正常組(P<0.05)；推拿組肝、肺組織中TLR4表達(dá)低于模型組(P<0.05)，推拿組和模型組NF-κB p65表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖5、6，表3、4。

表5 退熱六法對(duì)各組幼兔肝組織TLR4及NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

表6 退熱六法對(duì)各組幼兔肺組織TLR4及NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

圖3 退熱六法對(duì)各組幼兔肝組織TLR4/NF-κB p65表達(dá)的影響

圖4 退熱六法對(duì)各組幼兔肺組織TLR4/NF-κB p65表達(dá)的影響

3 討論

小兒推拿手法治療發(fā)熱有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，較口服及靜脈給藥更能獲得家長(zhǎng)的認(rèn)可[12]，其療效及機(jī)制問(wèn)題，是推拿學(xué)科關(guān)注的熱點(diǎn)之一，臨床上小兒推拿退熱的手法不統(tǒng)一，治療范疇及機(jī)制不明確，以致療效和安全性被質(zhì)疑。魏理珍等[13]研究發(fā)現(xiàn)清天河水可能通過(guò)抑制下丘腦正調(diào)節(jié)介質(zhì)前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量而降溫。臨床上推拿退熱效果顯著，推拿能下調(diào)發(fā)熱患兒外周血清TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子水平[14]。因此，本研究探討了推拿對(duì)炎癥性發(fā)熱的影響，結(jié)果提示推拿能明顯抑制發(fā)熱，抑制炎癥反應(yīng)，下調(diào)中性粒細(xì)胞比率，可能是通過(guò)TLR4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，耳緣靜脈注射0.5 μg/kg的LPS，造模成功率達(dá)83%，造模后1小時(shí)肛溫明顯升高，造模后3小時(shí)肛溫達(dá)最高峰，與基礎(chǔ)肛溫相比，約上升1.6℃，隨后肛溫逐漸下降，持續(xù)約6小時(shí)，與研究相符[8]。選取退熱六法作為干預(yù)方式，其中頭面四大手法屬于“和法”，可調(diào)節(jié)陰陽(yáng)，天人相應(yīng)，天河水倍受歷代醫(yī)者的推崇，均認(rèn)為清天河水是“清法”的重要代表，在各種熱證下均可施用，脊椎占督脈近三分之二的循行部位，推脊對(duì)督脈氣機(jī)有調(diào)節(jié)作用。推拿后即刻便會(huì)出現(xiàn)降溫現(xiàn)象，降溫幅度最高達(dá)1℃。

發(fā)熱是體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂的表現(xiàn)，是反應(yīng)炎癥性疾病的重要標(biāo)志，眾所周知，TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了慢性和急性炎癥反應(yīng)[15]，其中TLR4/NF-κB是炎癥調(diào)節(jié)的經(jīng)典信號(hào)通路，參與了炎癥性發(fā)熱的體液機(jī)制。炎性細(xì)胞因子能影響免疫反應(yīng)，并對(duì)各種組織或器官造成損傷[16]。TNF-α、IL-1β參與調(diào)節(jié)早期免疫反應(yīng)[17]，是發(fā)熱的關(guān)鍵介質(zhì)，其中肺臟、肝臟是失調(diào)炎癥反應(yīng)的潛在目標(biāo)?；蚯贸齌NF-α后注射LPS，發(fā)現(xiàn)小鼠體溫明顯升高，說(shuō)明TNF-α參與了負(fù)反饋機(jī)制，限制了發(fā)熱的程度[18]，有研究表明注射TNF-α血清抗體能影響發(fā)熱的早期階段[19]，這與推拿后能即刻降低體溫相似。IL-1β通過(guò)血液、體液途徑直接作用于中樞引起發(fā)熱[20]，中性粒細(xì)胞首先募集到發(fā)生感染的部位[21]，分泌IL-1β[22]，引起炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞具有兩重作用，一則產(chǎn)生抑菌作用，二則存在細(xì)胞毒性，所以當(dāng)其適當(dāng)發(fā)揮效應(yīng)后應(yīng)抑制其活化和浸潤(rùn)，防止對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害[23]，研究結(jié)果顯示，退熱六法作用于LPS模型兔后能抑制外周中性粒細(xì)胞增多，保護(hù)機(jī)體免受傷害。脂多糖是一種典型內(nèi)毒素，作為配體可以激活細(xì)胞膜上的TLR4，啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng)，上調(diào)促炎細(xì)胞因子。肝臟在調(diào)節(jié)各種新陳代謝、體內(nèi)平衡、宿主防御活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用，能清除細(xì)菌和內(nèi)毒素，發(fā)揮代謝、免疫等功能[24]，TLR4介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的肝組織損傷，使用TLR4抑制劑可以改善肝臟損傷和全身炎癥[25]，LPS誘導(dǎo)大量促炎性介質(zhì)將中性粒細(xì)胞募集到肺組織中，造成肺部的炎性損傷[26]，TLR4作為潛在的治療標(biāo)記，可用于抑制肺部的炎癥反應(yīng)，根據(jù)研究結(jié)果顯示，退熱六法干預(yù)能抑制肝臟和肺臟組織中TLR4的表達(dá)量。

綜上，本研究揭示了退熱六法對(duì)LPS引起的炎癥性發(fā)熱具有退熱作用，研究表明，退熱六法能抑制外周炎癥反應(yīng)，下調(diào)中性粒細(xì)胞比率，影響TLR4信號(hào)通路，下游通路不涉及NF-κB p65，這些結(jié)果為推拿治療小兒發(fā)熱提供了科學(xué)依據(jù)，回答了臨床上推拿退熱的部分理論機(jī)制。