柔肝方通過抑制纖維化蛋白抗肝纖維化的機(jī)制研究①

李茜 吳惠春 譚家鑫 黃凌鷹 高月求 李曼

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

肝纖維化是各種病因引起的慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)環(huán)節(jié)，其關(guān)鍵過程是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化并轉(zhuǎn)分化為肝成纖維細(xì)胞，大量合成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分，引起ECM的進(jìn)行性過度積累［1］。纖維化蛋白（fibrosin，F(xiàn)BRS）是一種由CD4+T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌的促進(jìn)纖維化的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)肌纖維母細(xì)胞的生成和膠原纖維的表達(dá)［2-4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)的FBRS水平與肝纖維化程度正相關(guān)，提示FBRS參與了肝纖維化的發(fā)病過程［5］。柔肝方（Rougan Formula）是上海市名中醫(yī)王靈臺(tái)教授治療肝纖維化的有效驗(yàn)方，以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為治則。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，柔肝方可顯著改善慢乙肝肝纖維化患者的癥狀、體征和肝功能，降低肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)RGF可抑制肝纖維化模型小鼠肝臟的膠原合成，但其機(jī)制尚不清楚［6-7］。因此，本研究在明確柔肝方主要成分基礎(chǔ)上，應(yīng)用肝纖維化小鼠模型和體外細(xì)胞模型，深入研究柔肝方抗肝纖維化的分子機(jī)制，為闡釋中藥抗肝纖維化提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞6~8周齡健康BALB/c雄性小鼠74只，體質(zhì)量18~21 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證為SCXK（浙）2019-0001，飼養(yǎng)于上海南方模式生物科技股份有限公司，動(dòng)物倫理IACUC號(hào)為2020-0018，喂食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200~220 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。人肝星狀細(xì)胞株LX2細(xì)胞購自上海復(fù)蒙基因生物公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和主要試劑柔肝沖劑為曙光醫(yī)院的院內(nèi)制劑（批號(hào)：Z05100975），購自上海曙光醫(yī)院藥房，組成如下：淫羊藿15 g、炙黃芪15 g、枸杞子12 g、炙鱉甲12 g、丹參30 g、郁金12 g、苦參12 g。對(duì)照品淫羊藿苷（貨號(hào)E-0062）、綠原酸（貨號(hào)E-0075）、黃芪甲苷（貨號(hào)E-0146）、芒柄花黃素（貨號(hào)E-0216）、丹參酮ⅡA（貨號(hào)E-0021）、丹酚酸B（貨號(hào)E-0136）、苦參堿（貨號(hào)E-0064）、氧化苦參堿（貨號(hào)E-0095），質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，均購自上海同田生物技術(shù)有限公司；Ⅳ型刀豆蛋白A（ConA，C2010）購自美國(guó)Sigma公司；小鼠的ALT測(cè)試盒、AST測(cè)試盒、LN酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、HA酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、PⅢNP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、Col-Ⅳ酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、HE染液購自南京建成生物技術(shù)研究所；Masson染液購自Solarbio公司；人重組FBRS蛋白購自Abnova；anti-α-SMA（ab124964）、anti-Col-Ⅰ（ab88147）和anti-TGF-β1（ab215715）購自英國(guó)Abcam公司；FBRS Polyclonal Antibody（PA5-60615）購自Thermo Fisher公司；GAPDH Antibody（60004-1-lg）購自Protein Tech公司；Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購自科諾迪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RGF化學(xué)成分及其入血成分的分析與鑒定應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)RGF及其含藥血清的化學(xué)成分進(jìn)行分析［8］，查閱《中華人民共和國(guó)藥典（2015年版）》分析柔肝方中各組成藥物的主要成分，使用淫羊藿苷、綠原酸、黃芪甲苷、芒柄花黃素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、苦參堿、氧化苦參堿作為對(duì)照品進(jìn)行成分分析。供試品的制備：分別取柔肝方于研缽中研磨，精密稱定柔肝方219.40 mg，加入甲醇溶液10 ml，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100 μl，加到液相小瓶中，上樣分析。血漿樣品處理方法：取血漿10 ml，加入30 ml乙腈，渦旋1 min后，4 000 r/min離心10 min，精密移取37.50 ml上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入500 L甲醇復(fù)溶，12 000 r/min離心10 min。精密吸取上清液100 L，轉(zhuǎn)移至液相小瓶，上樣分析。

1.2.2 動(dòng)物分組及模型建立74只BALB/c小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組分為正常對(duì)照組、模型組和柔肝方低、中、高劑量組（RGF-L、RGF-M、RGF-H），其中對(duì)照組6只，其余每組各17只。按公式：小鼠給藥劑量（g/kg）=成人用藥量（g）/成人標(biāo)準(zhǔn)體重（kg）×9.1為中劑量組，低劑量組為中劑量組的1/2濃度，高劑量組為中劑量組的2倍濃度。除對(duì)照組外，造模小鼠按照12.5 mg/kg小鼠體質(zhì)量予尾靜脈注射ConA試劑，1次/周，連續(xù)10周；對(duì)照組小鼠注射相應(yīng)劑量生理鹽水［9］。柔肝方組在造模當(dāng)日按照10 ml/kg小鼠體質(zhì)量灌服中藥，其余組則灌服等量飲用水，1次/d，共10周。在第10次注射ConA后次日采集小鼠標(biāo)本，取小鼠肝右葉約0.5 cm×0.5 cm大小的肝組織固定于4%多聚甲醛，48 h后經(jīng)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片后用于后續(xù)染色。以天狼猩紅染色和Masson染色的膠原表達(dá)半定量結(jié)果作為判斷肝纖維化程度的指標(biāo)。

1.2.3 各組小鼠肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)的測(cè)定稱量各組小鼠體質(zhì)量，分離肝臟和脾臟后稱重，分別計(jì)算肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)：肝臟指數(shù)（%）=肝臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%；脾臟指數(shù)（%）=脾臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%［10-13］。

1.2.4 HE染色取肝組織石蠟切片，60℃烤片30 min后依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ染缸中脫蠟，每次10 min，梯度乙醇逐級(jí)脫水，100%、95%、85%、70%各3 min，自來水沖洗3次，洗凈乙醇，蘇木素染色5 min，水洗1次，伊紅染色30 s，用增色液沖洗2次，晾干封片鏡檢并采集圖像。

1.2.5 天狼猩紅染色取肝組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，用紙擦干肝組織周圍水滴，滴加1滴天狼猩紅染液于肝組織上，將載玻片放于濕盒中，置于37℃恒溫箱中25 min，無水乙醇分化1 min，二甲苯透明1 s，中性樹膠封片鏡檢并采集圖像，使用Image-pro plus軟件進(jìn)行半定量分析陽性區(qū)域面積百分比。

沙美特羅替卡松聯(lián)合孟魯司特對(duì)比沙美特羅替卡松治療咳嗽變異性哮喘療效和安全性的Meta分析…… 馮文濤等（5）：699

1.2.6 Masson染色取肝組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染核，天青石藍(lán)染色液染10 min，充分水洗，麗春紅品紅染色液覆蓋住標(biāo)本10 min，使用0.2%冰醋酸水溶液去除浮色，滴加磷鉬酸水溶液分化處理1 min，用苯胺藍(lán)染色液染5 min，冰醋酸水溶液清洗玻片，無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固鏡下觀察，使用Image-pro plus軟件進(jìn)行半定量分析［14］。

1.2.7 肝功能指標(biāo)和肝纖四項(xiàng)檢測(cè)取各組小鼠血清，應(yīng)用生化法，根據(jù)ALT、AST、肝纖四項(xiàng)（HA、LN、PⅢNP、ColⅣ）說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定其水平。

1.2.8 Western blot取30 mg肝組織放入含1%PMSF的細(xì)胞裂解液中，勻漿后冰上放置30 min，12 000 g離心15 min取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度并制樣。每次上樣量為30 μg，上樣體積為10 μl。使用12.5%分離膠分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜4次后加入二抗，TBST洗膜4次后顯影，并使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量［15］。

1.2.9 柔肝方含藥血清制備30只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和柔肝方組（RGF組）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按1 ml/100 g灌胃體積予高劑量RGF灌胃，正常對(duì)照組灌服飲用水，每日早晚各灌胃1次，第3天灌胃后禁食、禁水12 h，第4天給藥1次后30 min腹主動(dòng)脈取血［16］。室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，過濾滅活后-80℃凍存，備用。

1.2.10 重組FBRS蛋白刺激LX2細(xì)胞LX2細(xì)胞按照3×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后，分為對(duì)照組和重組FBRS蛋白干預(yù)組，干預(yù)組分為不同時(shí)間和不同濃度，人重組FBRS蛋白（10 ng/ml）分別干預(yù)LX2細(xì)胞0 h、24 h和48 h，不同濃度FBRS蛋白（0、10、100 ng/ml）干預(yù)24 h。Western blot法檢測(cè)α-SMA表達(dá)。ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS表達(dá)。

1.2.11 柔肝方含藥血清對(duì)LX2細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用3×105個(gè)/孔的LX2細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)12 h，PBS洗2次，分為正常血清組、正常血清+FBRS刺激（100 ng/ml）組和柔肝方含藥血清+FBRS刺激組（100 ng/ml），10%血清培養(yǎng)48 h，Western blot法檢 測(cè)α-SMA水 平，Western blot和ELISA法 測(cè) 定Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柔肝方化學(xué)成分及其入血成分分析結(jié)果應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)柔肝方及其含藥血清的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品鑒定每克柔肝方中主要成分含量如下：綠原酸195.79 ng，黃芪甲苷88.52 ng，芒柄花黃素13.72 ng，淫羊藿苷1 186.46 ng，丹參酮ⅡA 6.93 ng，丹酚酸B 75 236.24 ng，苦參堿1.66 ng，氧化苦參堿24.91 ng。

柔肝方入血成分分析結(jié)果顯示，主要為淫羊藿苷、綠原酸、黃芪甲苷、芒柄花黃素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、苦參堿和氧化苦參堿，詳見表1。

表1 柔肝方入血成分鑒定情況Tab.1 Identification of serum components of Rougan Formula

2.2 柔肝方降低ConA肝纖維化模型小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)尾靜脈注射ConA建立肝纖維化小鼠模型，并予柔肝方不同劑量進(jìn)行治療。與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)明顯增高（P<0.01，P<0.001）；與模型組相比，柔肝方組肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均有下降趨勢(shì)，其中高劑量組降低最為顯著（P<0.001，圖1）。

圖1 柔肝方對(duì)ConA肝纖維化模型小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Rougan Formula on liver index and spleen index of ConA-induced hepatic fibrosis model mice

2.3 柔肝方改善ConA肝纖維化模型小鼠肝組織炎癥、減少膠原沉積如圖2所示，HE染色結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝索呈放射狀排列，排列規(guī)則，無變形、壞死；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，可見多處肝組織壞死區(qū)域，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比，柔肝方各用藥組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度明顯減輕，炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞明顯減少。天狼猩紅染色和Masson染色結(jié)果表明，對(duì)照組未見膠原沉積；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，膠原沉積明顯增多，形成了纖維間隔，甚至假小葉形成；與模型組相比，柔肝方用藥組膠原沉積呈劑量依賴性減少。

圖2 柔肝方對(duì)小鼠肝組織炎癥和膠原沉積的改善作用Fig.2 Effects of Rougan Formula on inflammation and collagen deposition in mice liver tissue

2.4 柔肝方改善ConA模型小鼠的肝功能和降低血清肝纖維化指標(biāo)表達(dá)的作用與對(duì)照組相比，ConA模型組小鼠血清ALT、AST、肝纖四項(xiàng)（HA、LN、PⅢNP、Col-Ⅳ）水平顯著升高（P<0.001）；與模型組相比，柔肝方組ALT、AST、肝纖四項(xiàng)水平較模型組有明顯降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 柔肝方對(duì)小鼠肝功能和纖維化指標(biāo)的改善作用Fig.3 Effects of Rougan Formula on liver function and fibrosis related items in mice

2.5 柔肝方降低ConA肝纖維化模型小鼠肝組織FBRS的表達(dá)為探究柔肝方抑制ConA肝纖維化模型小鼠肝臟膠原沉積的分子機(jī)制，檢測(cè)了柔肝方對(duì)肝內(nèi)肝星狀細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，柔肝方可明顯降低模型小鼠肝組織的α-SMA、Col-Ⅰ、TGF-β1、FBRS的表達(dá)水平（P<0.01，P<0.001），提示柔肝方可能通過抑制肝星狀細(xì)胞的活化、減少膠原沉積發(fā)揮抗肝纖維化的作用。見圖4。

圖4 柔肝方對(duì)肝組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、FBRS蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig.4 Effects of Rougan Formula regulating protein expressions of TGF-β1，α-SMA，Col-Ⅰand FBRS

2.6 重組FBRS蛋白可誘導(dǎo)LX2細(xì)胞活化為明確柔肝方抑制肝星狀細(xì)胞活化的機(jī)制，體外應(yīng)用重組FBRS蛋白刺激人肝星狀細(xì)胞系LX2。結(jié)果表明，隨著重組FBRS蛋白濃度和作用時(shí)間的增加，LX2細(xì)胞表達(dá)α-SMA水平逐漸增加，提示FBRS可以活化肝星狀細(xì)胞。此外，重組FBRS蛋白可上調(diào)LX2胞內(nèi)和分泌的Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS表達(dá)水平（P<0.05），其中胞內(nèi)蛋白應(yīng)用Western blot法測(cè)定，分泌蛋白應(yīng)用ELISA法測(cè)定。見圖5。

圖5 重組FBRS蛋白對(duì)LX2細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用Fig.5 Effects of recombinant FBRS proteins activating in LX2 cells

2.7 柔肝方含藥血清可抑制FBRS誘導(dǎo)的LX2細(xì)胞的活化應(yīng)用柔肝方藥物血清干預(yù)經(jīng)FBRS刺激的LX2細(xì)胞，結(jié)果表明柔肝方含藥血清不僅抑制FBRS誘導(dǎo)的LX2表達(dá)α-SMA，且抑制LX2的胞內(nèi)和分泌的Col-Ⅰ、TGF-β1、FBRS水平（P<0.05，圖6），提示柔肝方通過抑制FBRS誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，抑制膠原分泌，發(fā)揮抗纖維化作用。

圖6 柔肝方抑制LX2細(xì)胞激活和膠原沉積Fig.6 RGF inhibits activation and collagen deposition of LX2 cells

3 討論

肝纖維化是慢性或反復(fù)肝損傷的最終共同途徑，急性的、自限性纖維化是一種對(duì)組織損傷可逆的保護(hù)性反應(yīng)，終末期肝纖維化導(dǎo)致肝硬化，伴有危及生命的后果，但目前除病因治療或肝移植，仍沒有公認(rèn)的治療肝纖維化的有效方法［17-18］。中醫(yī)藥在肝纖維化的治療上有明確優(yōu)勢(shì)，明確其抗肝纖維化的機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)新的肝纖維化治療靶點(diǎn)及有效藥物［19］。

3.1 柔肝方是治療肝纖維化的有效驗(yàn)方柔肝方是曙光醫(yī)院肝病科治療肝纖維化的有效驗(yàn)方，前期臨床研究證實(shí)柔肝方聯(lián)合恩替卡韋治療乙肝后肝纖維化患者，其肝功能指標(biāo)、肝臟彈性值的改善作用明顯優(yōu)于恩替卡韋對(duì)照治療組［20］。柔肝方對(duì)CHB患者具有一定的抑制病毒復(fù)制的作用，病理結(jié)果顯示有一定的抗炎、抗纖維化作用，其療效與抑制HSC的激活有關(guān)［6-7］。

3.2 FBRS在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用TGF-β1是目前已知的致肝纖維化最重要的細(xì)胞因子，可來源于自分泌和旁分泌。發(fā)生肝纖維化時(shí)，TGF-β1生成顯著增多，刺激HSC轉(zhuǎn)化為MFB，產(chǎn)生大量ECM，導(dǎo)致肝纖維化［21-22］。1993年，F(xiàn)BRS作為一種新的促纖維化的細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)，其在血吸蟲性肝纖維化和酒精性肝纖維化時(shí)均有高表達(dá)［2，23-24］。研究表明，F(xiàn)BRS會(huì)促進(jìn)表達(dá)α-SMA的肌纖維母細(xì)胞的生成，同時(shí)促進(jìn)膠原纖維的表達(dá)［4］。宗欣等［25］研究表明，隨著肝纖維化的程度不同，血清FBRS mRNA表達(dá)水平隨肝臟膠原沉積水平同步升高。另外，肝組織FBRS mRNA表達(dá)水平與肝纖四項(xiàng)檢查均呈正相關(guān)。前期研究中，發(fā)現(xiàn)CHB患者肝纖維化的程度越高，其外周血CD4+T細(xì)胞的FBRS表達(dá)水平越高，表明CD4+T細(xì)胞的FBRS表達(dá)與肝纖維化程度密切相關(guān)，但相關(guān)的機(jī)制尚未探討［5］。

3.3 柔肝方通過調(diào)節(jié)FBRS表達(dá)抗肝纖維化的機(jī)制本研究中，應(yīng)用ConA肝纖維化模型小鼠證實(shí)，柔肝方可減少組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕炎癥反應(yīng)，降低血清ALT、AST水平，減少小鼠肝內(nèi)膠原沉積，與前期CCL4肝纖維化模型的研究結(jié)果一致［26］。α-SMA是HSC活化的標(biāo)志物，RGF可下調(diào)肝纖維化模型小鼠肝組織α-SMA、Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS表達(dá)，提示柔肝方可抑制HSC的活化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)FBRS表達(dá)有關(guān)。

體外研究證實(shí)，重組FBRS蛋白可誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞LX2細(xì)胞表達(dá)α-SMA，提示FBRS可作為誘導(dǎo)LX2活化的始動(dòng)因素之一。進(jìn)一步應(yīng)用柔肝方藥物血清干預(yù)，證實(shí)柔肝方可降低FBRS上調(diào)的α-SMA、Col-Ⅰ和TGF-β1表達(dá)，提示柔肝方對(duì)FBRS誘導(dǎo)的LX2細(xì)胞活化具有抑制作用。FBRS可上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，但在TGF-β1在FBRS誘導(dǎo)LX2細(xì)胞活化中的作用仍有待研究。

3.4 柔肝方抗肝纖維化可能的效應(yīng)物質(zhì)鑒定柔肝方的主要入血成分是淫羊藿苷、綠原酸、丹酚酸B、黃芪甲苷、芒柄花黃素、丹參酮ⅡA、苦參堿、氧化苦參堿，其可能是抗纖維化作用的主要物質(zhì)。有研究表明，淫羊藿苷能抑制HSC的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和膠原蛋白的降解，對(duì)CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型具有保肝作用［27］。丹酚酸B通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad和MAPK信號(hào)通路減輕肝纖維化，特別是抑制MAPK介導(dǎo)的P-Smad2/3L信號(hào)通路［28］。綠原酸能夠劑量依賴性的改善CCL4導(dǎo)致的肝纖維化大鼠的肝功能和氧化應(yīng)激，抑制膠原纖維的增生起到保肝和抗肝纖維化作用［29］。在今后的實(shí)驗(yàn)中，將針對(duì)柔肝方主要入血成分的抗肝纖維化作用進(jìn)行篩選和鑒定，以期進(jìn)一步明確柔肝方抗肝纖維化的效應(yīng)物質(zhì)。

綜上，本研究在明確FBRS誘導(dǎo)HSC活化的基礎(chǔ)上，初步探討中藥柔肝方通過調(diào)節(jié)FBRS抗肝纖維化的機(jī)制。將在后續(xù)研究中，應(yīng)用已建立的FBRS誘導(dǎo)HSC活化的篩選體系對(duì)柔肝方的各主要活性成分進(jìn)行抗肝纖維化作用的篩選，為明確中藥柔肝方肝纖維化的機(jī)制提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)，為開發(fā)有效的機(jī)制明確的現(xiàn)代中藥奠定基礎(chǔ)。