陳茂姣,鄧燕琴,何娓娓,蘭 寧,張紅梅
四川新希望乳業(yè)有限公司洪雅陽平分公司,四川眉山 620360
高效液相色譜法因其具有測(cè)量精度高、穩(wěn)定性好、測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用在定量檢測(cè)中。但檢測(cè)結(jié)果也受到很多因素的影響[1],比如儀器的各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置、色譜柱的種類和長短、色譜柱的填充物和孔徑、流動(dòng)相的比例等。其中流動(dòng)相的比例對(duì)目標(biāo)物的出峰時(shí)間、峰型的良好與否有很大的關(guān)系。不適宜的流動(dòng)相有可能造成雙峰、拖尾峰、峰展寬、保留時(shí)間不斷變動(dòng)、靈敏度不高的問題,檢測(cè)出的結(jié)果也不可靠,可能會(huì)導(dǎo)致假陽性或假陰性。合適的流動(dòng)相比例可以使目標(biāo)物的峰型左右對(duì)稱,與雜峰分離良好,獲得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。本文通過液相色譜儀檢測(cè)三聚氰胺的含量[2],研究不同流動(dòng)相比例對(duì)三聚氰胺檢測(cè)結(jié)果的影響,從而找出方法中最適宜檢測(cè)三聚氰胺的流動(dòng)相比例。
本文使用方法為《GB/T 22388—2008 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》中的第一法高效液相色譜法。待測(cè)樣品經(jīng)過三氯乙酸和乙腈的提取后[3],經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化,氮吹后用流動(dòng)相定容,經(jīng)有機(jī)濾頭過濾后,用高效液相色譜測(cè)定,外標(biāo)法定量。
甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純),默克化工技術(shù)(上海)有限公司;三氯乙酸(優(yōu)級(jí)純)、氨水(分析純),成都市科隆化學(xué)品有限公司;檸檬酸(分析純),福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;辛烷磺酸鈉(優(yōu)級(jí)純),成都市科隆化學(xué)品有限公司;三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。
配制離子對(duì)試劑緩沖液:準(zhǔn)確稱取2.10 g檸檬酸和2.16 g辛烷磺酸鈉,加入約980 mL水溶解,調(diào)節(jié)pH至3.0后,定容至1 L備用。
高效液相色譜儀[LC-1260(VWD)],安捷倫科技(中國)有限公司;渦旋振蕩器,上海瀘析實(shí)業(yè)有限公司;調(diào)速多用振蕩器,常州市凱航儀器有限公司;超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;分析天平,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。
分別移取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、5.0 mL濃度為100 mg/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中,用流動(dòng)相分別定容至刻度線,混勻備用,得到0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用流動(dòng)相進(jìn)行定容的,測(cè)試不同流動(dòng)相比例需要重新配制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.4.1 色譜柱
C18柱,4.6×250 mm,5μm,安捷倫科技(中國)有限公司。
2.4.2 參數(shù)設(shè)置
進(jìn)樣量:20μL;波長:240nm;柱溫:40 ℃;流速:1 mL/min。
2.4.3 流動(dòng)相
離子對(duì)試劑緩沖液和乙腈按照不同比例混勻。
稱取2 g(精確至000.1 g)試樣于50 mL離心管中,加入15 mL 2%三氯乙酸溶液和5 mL乙腈,超聲10 min,取出后震蕩10 min,最后6000 r/min離心10 min,離心后的上清液經(jīng)定性濾紙過濾至25 mL比色管中,用2%三氯乙酸溶液定容至25 mL。取5 mL濾液與5 mL超純水混勻,經(jīng)固相萃取柱凈化后,用5%的氨化甲醇洗脫,收集洗脫液,在50 ℃水浴下用氮吹儀吹至近干,最后用1 mL流動(dòng)相定容,用0.22 μm有機(jī)濾頭過濾后上機(jī)測(cè)定。
每次上機(jī)檢測(cè)需要測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(當(dāng)前流動(dòng)相比例定容)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)連續(xù)測(cè)3 次、陰性本底、陰性本底加標(biāo),并做三次平行。觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的出峰時(shí)間、本底加標(biāo)的回收率、標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的峰型與峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為85:15時(shí),出峰時(shí)間為9 min左右,回收率為91.9%~92.0%,但分離度不好,與雜峰有粘連,如表1和圖1所示。
表1 流動(dòng)相比例為85:15的檢測(cè)結(jié)果
圖1 流動(dòng)相比例為85:15的峰型
離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為88:12時(shí),出峰時(shí)間為12.9 min左右,回收率為79.9%~84.8%,回收率差,且峰型有輕微拖尾,如表2和圖2所示。
表2 流動(dòng)相比例為88:12的檢測(cè)結(jié)果
圖2 流動(dòng)相比例為88:12的峰型
離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為90:10時(shí),出峰時(shí)間為17.3 min左右,回收率為92.1%~96.2%,分離度較好,峰型左右對(duì)稱,如表3和圖3所示。
表3 流動(dòng)相比例為90:10的檢測(cè)結(jié)果
圖3 流動(dòng)相比例為90:10的峰型
離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為92:8時(shí),出峰時(shí)間為24.5 min左右,回收率為82.5%~86.2%,但分離度不好,雜峰較多,如表4和圖4所示。
表4 流動(dòng)相比例為92:8的檢測(cè)結(jié)果
圖4 流動(dòng)相比例為92:8的峰型
離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為95:5時(shí),出峰時(shí)間為40.7 min左右,出峰時(shí)間太長,回收率為89.3%~109.9%,回收率不穩(wěn)定,與雜峰分離度不好,峰拖尾,如表5和圖5所示。
表5 流動(dòng)相比例為95:5的檢測(cè)結(jié)果
圖5 流動(dòng)相比例為95:5的峰型
流動(dòng)相中離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果起著至關(guān)重要的作用。乙腈含量高時(shí),目標(biāo)峰出峰時(shí)間相對(duì)短一些,能提高檢測(cè)速度,乙腈含量低時(shí),目標(biāo)峰出峰時(shí)間相對(duì)長一些,檢測(cè)時(shí)間較長。選擇流動(dòng)相比例時(shí)要綜合考慮目標(biāo)峰保留時(shí)間的長短,與雜峰和溶劑峰的分離度,峰型,是否拖尾,目標(biāo)物的回收率等情況[3]。流動(dòng)相比例為92:8與95:5時(shí),目標(biāo)峰出峰時(shí)間較遲,會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)速度過慢。比例為92:8時(shí)雜峰較多,與溶劑峰分離度不好,回收率為82.5%~86.2%。流動(dòng)性比例90:10時(shí)保留時(shí)間為17.3 min左右,保留時(shí)間合適,且回收率較好,分離度好,峰型左右對(duì)稱,為最佳比例。