徐祥，徐建彬，梁斌，徐俊

河南省白酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（信陽(yáng) 464400）

白酒是我國(guó)特有的民族傳統(tǒng)產(chǎn)品，有著上千年的歷史，與伏特加、白蘭地、朗姆酒、威士忌、金酒并列為世界六大蒸餾酒[1]。中國(guó)白酒主要是以糧谷為主要原料，用大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的[2]。白酒中除乙醇和水以外，還含有1%左右的有機(jī)物，如有機(jī)酸（醋酸，乳酸，蘋果酸，酒石酸和亞油酸等）、酯類（乙酸乙酯，乳酸乙酯和己酸乙酯等）、內(nèi)酯、酚類、醇類、雜環(huán)、萜烯和芳香族化合物等。這些有機(jī)物對(duì)白酒的風(fēng)味起到及其重要的作用[3]。

甜味劑是一類重要的賦予食品以甜味，可提高食品品質(zhì)的食品添加劑。在現(xiàn)代食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的甜味劑主要包括乙?；前匪徕洠ò操惷郏⑧彵郊柞；酋０封c（糖精鈉）、環(huán)己基氨基磺酸鈉（甜蜜素）、三氯蔗糖（蔗糖素）等[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，攝入高劑量的甜味劑會(huì)對(duì)人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害，甚至引發(fā)癌癥。因此，甜味劑在生產(chǎn)中合理的使用，不僅關(guān)系到產(chǎn)品的品質(zhì)，更關(guān)系到消費(fèi)者的安全與健康[7]。針對(duì)白酒來(lái)說(shuō)，一些生產(chǎn)企業(yè)在白酒生產(chǎn)過(guò)程中從自身利益出發(fā)，為掩蓋白酒的苦澀和保持酒體干冽、醇厚、綿軟的口感，違法添加甜味劑如安賽蜜、糖精鈉等來(lái)改善白酒的口感。也有企業(yè)因原材料進(jìn)貨把關(guān)不嚴(yán)，使用含有甜味劑的酒用香精香料，造成白酒產(chǎn)品中甜味劑超標(biāo)。但GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[8]中明確規(guī)定，白酒在生產(chǎn)過(guò)程中不允許添加人工甜味劑。

目前關(guān)于食品中甜味劑的檢測(cè)方法較多，如高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[9-13]、超高壓液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[14-15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)甜味劑的報(bào)道[16-18]。液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法雖是檢測(cè)白酒中甜味劑的最佳方法，但其設(shè)備比較昂貴，難以普及，應(yīng)用范圍受限。試驗(yàn)結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中安賽蜜、糖精鈉的測(cè)定方法[19-20]，優(yōu)化白酒中安賽蜜、糖精鈉的樣品前處理步驟，探索各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。該試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和白酒企業(yè)中安賽蜜、糖精鈉的日常檢測(cè)具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機(jī)濾膜（孔徑0.22 μm，津?。?；水（娃哈哈純凈水）；甲醇、乙酸銨[色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；食品甜味劑乙?；前匪徕洠ò操惷郏┤芤簶?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[1.00 mg·mL-1，GBW（E）100171]、食品甜味劑糖精鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[1.00 mg·mL-1，GBW（E）100166）：北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司。

乙酸銨溶液（20 mmol·L-1）：稱取1.54 g乙酸銨，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過(guò)濾后備用。

白酒樣品由河南五谷春酒業(yè)股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、OpenLabChemStation工作站，安捷倫科技有限公司）；1 000 mL全玻璃微孔過(guò)濾器（津隆）；ML204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18，柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm。柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：甲醇-乙酸銨溶液=20∶80（V/V）；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確移取安賽蜜、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用純凈水稀釋成1，5，10，20和30 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度。在最佳的色譜條件下，分別取10 μL進(jìn)行色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品測(cè)定

樣品前處理：準(zhǔn)確量取25 mL酒樣于50 mL玻璃燒杯中，水浴加熱至酒樣近干，用娃哈哈純凈水定容至25 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件的優(yōu)化2.1.1 柱溫的影響

通過(guò)多次試驗(yàn)，詳細(xì)考察了不同柱溫對(duì)安賽蜜和糖精鈉的保留時(shí)間、樣品峰的對(duì)稱性及樣品的響應(yīng)值等影響。將柱溫分別設(shè)定10，20，30，40和50 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，如圖1所示。溫度較低時(shí)，糖精鈉的色譜峰較寬，響應(yīng)值較低。隨著溫度的升高，安賽蜜和糖精鈉保留時(shí)間逐漸縮短，樣品峰的對(duì)稱性逐漸增高，樣品的響應(yīng)值逐漸增強(qiáng)。但是考慮到溫度過(guò)高，對(duì)色譜柱的使用壽命有重大影響，所以將柱溫的優(yōu)化溫度選擇為40 ℃。

圖1 不同柱溫條件下安賽蜜和糖精鈉的色譜圖

2.1.2 流動(dòng)相的影響

試驗(yàn)以GB 5009.28—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》和GB/T 5009.140—2003《飲料中乙酰磺胺酸鉀的測(cè)定》為依據(jù)。由于GB/T 5009.140—2003中流動(dòng)相配制過(guò)程繁瑣，且乙腈毒性相對(duì)較大，對(duì)操作者有潛在的危害，所以選擇GB 5009.28—2016中流動(dòng)相（甲醇-乙酸銨溶）液。如圖2所示，甲醇與乙酸銨溶液比例少量變化就會(huì)對(duì)安賽蜜與糖精鈉的保留時(shí)間有較大影響。隨著甲醇比例的增加，安賽蜜與糖精鈉的保留時(shí)間逐漸縮短，樣品的響應(yīng)值逐漸增強(qiáng)。但是當(dāng)甲醇比例超過(guò)20%時(shí)，樣品保留時(shí)間縮短變化不明顯，且兩峰距離較近，不利于準(zhǔn)確定量。綜合靈敏度和分離度等因素考慮，將流動(dòng)相甲醇與乙酸銨溶液比例設(shè)置為20∶80（V/V）。

圖2 流動(dòng)相甲醇與乙酸銨溶液不同比例條件下安賽蜜和糖精鈉的色譜圖

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

由于白酒中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，在進(jìn)行液相色譜分離時(shí)，容易對(duì)甜味劑在色譜柱的保留性能產(chǎn)生影響[21]。通過(guò)圖3中（a）與（b）對(duì)比發(fā)現(xiàn)，樣品未經(jīng)前處理直接進(jìn)樣后，譜圖較復(fù)雜，對(duì)糖精鈉的響應(yīng)吸收有重要影響，且樣品中的某種物質(zhì)與安賽蜜的色譜峰有部分重疊，影響安賽蜜的準(zhǔn)確定量。因此，樣品必須經(jīng)過(guò)前處理，減少乙醇等其他物質(zhì)的影響。樣品在GB/T 5009.140—2003中經(jīng)過(guò)前處理約稀釋了10倍，在GB 5009.28—2016中約稀釋了25倍。用稀釋的辦法確實(shí)可以解決酒樣基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題，減少乙醇等其他物質(zhì)的影響。但因方法的定量限較高，不符合實(shí)際樣品的檢測(cè)，因此稀釋方法不適合所有白酒中痕量甜味劑的檢測(cè)[18]。試驗(yàn)采用水浴加熱的方法降低白酒中乙醇等其他物質(zhì)的含量，減小其對(duì)色譜峰的影響，減弱基質(zhì)效應(yīng)。通過(guò)圖3（c）與（d）對(duì)比發(fā)現(xiàn)，通過(guò)水浴加熱的方式進(jìn)行前處理，樣品的色譜峰與安賽蜜和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液混合液的色譜峰的保留時(shí)間，響應(yīng)值基本保持一致，排除了乙醇等物質(zhì)的影響。

圖3 色譜圖

2.3 線性范圍和檢出限

配制安賽蜜、糖精鈉質(zhì)量濃度范圍在1～30 μg·mL-1的系列標(biāo)樣溶液，按試驗(yàn)確定的最佳色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，獲得不同質(zhì)量濃度下各組分的峰面積。將組分峰面積相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制工作曲線，各組分的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)如表1所示。樣品中甜味劑的定量范圍為1～30 μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)r＞0.999 9，可以滿足日常檢測(cè)的要求。在記錄的色譜圖中，以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）分別計(jì)算對(duì)應(yīng)目標(biāo)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得出目標(biāo)化合物的檢出限和定量限。安賽蜜的檢出限為0.15 mg·kg-1，定量限為0.35 mg·kg-1；糖精鈉的檢出限為0.75 mg·kg-1，定量限為1.7 mg·kg-1，遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)方法的規(guī)定。

表1 兩種甜味劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 方法的回收率和精密度

試驗(yàn)采用空白基質(zhì)添加不同濃度的目標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在已優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量。分別移取質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的安賽蜜、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，制成質(zhì)量濃度為2，4和20 μg·mL-1的加標(biāo)溶液，按1.5小節(jié)進(jìn)行樣品處理，按照最佳優(yōu)化條件下進(jìn)行色譜分析，平行測(cè)定6次，具體情況見(jiàn)表2。由表2可以看出，安賽蜜的加標(biāo)回收率在92.81%～100.58%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.23%～4.46%之間；糖精鈉的加標(biāo)回收率在95.34%～101.93%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.41%～6.64%之間，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 兩種甜味劑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率

2.5 樣品檢測(cè)結(jié)果

在上述建立的色譜條件基礎(chǔ)上，對(duì)河南五谷春酒業(yè)股份有限公司提供的酒樣1#，2#，3#，4#，5#和6#進(jìn)行色譜檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如表3所示。所檢測(cè)酒樣中均未檢出安賽蜜、糖精鈉，所測(cè)結(jié)果符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蒸餾酒中甜味劑含量的要求。

表3 酒樣中兩種甜味劑的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)以上試驗(yàn)，建立了一種采用高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)白酒中安賽蜜與糖精鈉兩種甜味劑的方法。該方法快速、高效、準(zhǔn)確，能夠在3 min內(nèi)完成樣品的分析，大大節(jié)省了單次單個(gè)檢測(cè)耗費(fèi)的試劑和時(shí)間，提高了工作效率。白酒樣品只需進(jìn)行水浴加熱后定容，即可進(jìn)樣檢測(cè)，彌補(bǔ)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的前處理復(fù)雜，不適合所有白酒中痕量甜味劑的檢測(cè)不足之處，對(duì)保護(hù)白酒生產(chǎn)企業(yè)和消費(fèi)者的利益起到了很大的作用。該方法的精密度和精確性均較好，可望在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)的市場(chǎng)監(jiān)測(cè)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。