谷睿 鄒蓉 唐健民 朱成豪 寧莞權(quán) 曹其義

摘要：為測(cè)定5種山茶科植物（普通油茶、博白大果油茶、宛田紅花油茶、金花茶、大果石筆木）葉片總黃酮含量，并比較其黃酮對(duì)·OH、DPPH·和O-2·的清除作用和總還原力。通過優(yōu)化超聲波萃取普通油茶葉總黃酮工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定最佳提取條件為超聲波低頻（35 kHz）、超聲功率452.4 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1 g ∶51.5 mL、提取溫度63.5 ℃、提取時(shí)間37.2 min，在該最佳條件下測(cè)得的博白大果油茶總黃酮得率最高（8.67%），其次是宛田紅花油茶（6.97%）、普通油茶（4.96%）、金花茶（1.64%）、大果石筆木（0.48%）?？寡趸钚员容^結(jié)果表明，普通油茶、博白大果油茶、宛田紅花油茶都具有明顯較好的抗氧化活性。因此，這3種植物葉片都適宜作為黃酮提取的工業(yè)原料，其中普通油茶更易獲取，最適合作為抗氧化保健茶葉產(chǎn)品的原料。

關(guān)鍵詞：普通油茶;響應(yīng)面優(yōu)化;總黃酮;提取工藝;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）04-0163-07

收稿日期：2021-05-01

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金（編號(hào)：2020GXNSFAA259029、2017GXNSFBA198011）;中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)基金（編號(hào)：桂科ZY1949013）;廣西科技基礎(chǔ)和人才專項(xiàng)（編號(hào)：桂科AD17129022）;廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（編號(hào)：ZRJJ2018-9）;廣西植物研究所基本業(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào)：桂植業(yè)18013、桂植業(yè)18014、桂植業(yè)19002）。

作者簡(jiǎn)介：谷 睿（1993—），男，安徽馬鞍山人，碩士研究生，主要從事藥用植物景觀應(yīng)用研究。E-mail：593763134@qq.com。

通信作者：唐健民，碩士，助理研究員，主要從事藥用植物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)研究。E-mail：1499494130@qq.com。

黃酮是一種強(qiáng)抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，其抗氧化能力是維生素E的10倍以上，這種抗氧化作用可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，阻止癌癥的發(fā)生，同時(shí)還具有提高免疫力、降血脂、降血壓等功效。目前，市面上生物類黃酮加工而成的食品以茶葉、蜂膠、銀杏、山楂、沙棘、蕎麥、柑桔皮等加工品最多[1]。茶葉作為一種國(guó)際性飲料，富含多種黃酮類化合物，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，早已成為我國(guó)國(guó)際貿(mào)易的重要商品，但目前山茶科植物葉中的黃酮資源利用較少。如油茶以采果實(shí)為主，葉片往往任其自然凋落，在油茶的整形修剪、低產(chǎn)油茶林的改造過程中，大量的油茶葉常被作為廢棄物而丟棄，極大地浪費(fèi)了資源[2-3]。因此，筆者于2019年7—9月在廣西植物研究所植物保育生物學(xué)研究組實(shí)驗(yàn)室開展普通油茶（Camellia oleifera）總黃酮提取工藝優(yōu)化研究，并與其他4種山茶科植物山茶屬博白大果油茶（Camellia gigantocarpa Hu et Huang）、宛田紅花油茶（Camellia polyodonta How ex Hu）、金花茶（Camellia nitidissima）以及石筆木屬大果石筆木[Pyrenaria spectabilis（Charp.）C. Y. Wu & S.X.Yang]的黃酮含量和抗氧化活性進(jìn)行比較，以更深入了解相關(guān)山茶科植物葉片中的黃酮含量及抗氧化能力，對(duì)黃酮資源進(jìn)一步開發(fā)和利用具有一定的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 試驗(yàn)材料為2019年7月采自廣西植物研究所桂林植物園的普通油茶、博白大果油茶、宛田紅花油茶、金花茶和大果石筆木鮮葉，挑選無病無蟲害的完整葉片進(jìn)行清洗，置于 55 ℃ 烘箱烘干后粉碎過60目篩備用。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：MUST-12040302），由中國(guó)食品藥品檢定研究所提供;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純，均購自桂林卓一生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DL-720E智能超聲波、電子分析天平（AE200S型，精度為0.1 mg），均購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精確稱取真空干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用乙醇溶解制成 0.4 mg/mL 的對(duì)照品溶液。分別取制備好的對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于 25 mL 容量瓶中。加10 mL 50%乙醇，加1 mL 5%亞硝酸鈉，混勻，靜置6 min;加1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min;加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用50%乙醇調(diào)至刻度，混勻，得空白液、對(duì)照品溶液;靜置15 min后在190～900 nm處進(jìn)行光譜掃描，確定選用510 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)[4]。

以吸光度為縱坐標(biāo)（Y）、總黃酮濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程為Y=12.623X+0.003，r2=0.999 2，總黃酮濃度在0.001 6～0.0160 mg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.2.2 供試品單因素試驗(yàn) 稱取各植物葉樣品粉末0.5 g，按照一定料液比（1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL、1 g ∶60 mL）加入一定體積分?jǐn)?shù)（20%、40%、60%、80%、100%）的乙醇。采用超聲波輔助提取法，以高頻（61 kHz）或低頻（35 kHz）設(shè)置一定功率（60、180、300、420、540 W），在一定溫度（40、50、60、70、80 ℃）下提取一定時(shí)間（10、30、50、70、90 min），收集濾液定容至50 mL備用。搖勻后取1 mL供試品溶液于25 mL容量瓶中，加入試劑的方法同“1.2.1”節(jié)中的步驟，最終得供試樣品，靜置15 min后同樣選用510 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)進(jìn)行光譜掃描。為提高結(jié)果的精準(zhǔn)度，每個(gè)單因素制作5次重復(fù)，記錄吸光度數(shù)據(jù)并計(jì)算制圖[5-7]。

總黃酮得率的計(jì)算方法：得率=C×Vm×100%，式中：C為提取液中總黃酮的濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;m為樣品粉末質(zhì)量，mg。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析 采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)[8]。根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，從單因素試驗(yàn)中選取對(duì)提取結(jié)果影響比較大的4個(gè)因素（料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間）為自變量，總黃酮得率為響應(yīng)值，共計(jì)29個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見表1。

1.2.4 總黃酮體外抗氧化活性試驗(yàn) 在響應(yīng)面分析得到的最佳條件下獲得這5種植物葉總黃酮提取液，再過濾于50 mL容量瓶中，加無水乙醇調(diào)至 50 mL 刻度線處，作為樣液待用。參照朱成豪等的方法[5-6，9-10]，結(jié)合自己的試驗(yàn)略作調(diào)整，進(jìn)行總黃酮對(duì)·OH、DPPH·、O-2·的清除測(cè)定試驗(yàn)。

1.2.4.1 總黃酮對(duì)·OH的清除測(cè)定試驗(yàn) 試管中加入1 mL 0.75 mol/L鄰二氮菲，2 mL pH值為7.45的磷酸鹽緩沖（PBS）溶液，1 mL蒸餾水，1 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 0.01% H2O2，充分混勻后于 37 ℃ 條件下恒溫水浴1 h。在536 nm處測(cè)定其吸光度（D0）;用1 mL水代替H2O2，并測(cè)定其吸光度（D1）;分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL樣液，用蒸餾水調(diào)到 1 mL，得到的不同濃度的樣液代替1 mL水，測(cè)定其吸光度（D2）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以維生素C作對(duì)照。

·OH清除率=（D2-D0）/（D1-D0）×100%。

1.2.4.2 總黃酮對(duì)DPPH·的清除測(cè)定試驗(yàn) 用無水乙醇配制0.04 mg/mL 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH溶液，分別取不同植物樣液2 mL，加入2 mL DPPH溶液，混勻后在室溫暗處避光反應(yīng) 30 min，在517 nm處測(cè)定其吸光度（D1）。分別取不同植物樣液2 mL，加入2 mL無水乙醇，同樣在 517 nm 處測(cè)定其吸光度（D2）;2 mL的DPPH溶液與2 mL無水乙醇等體積混合液的吸光度為D0。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以維生素C作對(duì)照。

DPPH·清除率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%。

1.2.4.3 總黃酮對(duì)O-2·的清除測(cè)定試驗(yàn)

取 5 mL 0.05 mol/L pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液，在25 ℃水浴預(yù)熱20 min，加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL樣液與蒸餾水混合得到1 mL不同濃度的樣液，加入0.5 mL 25 mmol/L鄰苯三酚，混勻后在 25 ℃ 水浴準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即加入2滴8 mol/L HCl終止反應(yīng)。在299 nm處測(cè)定吸光度（D1），用 1 mL 樣液代替樣液作為對(duì)照組的吸光度（D0）。將鄰苯三酚溶液用0.5 mL蒸餾水代替，得到吸光度（D2）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以維生素C作對(duì)照。

O-2·清除率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%。

1.2.4.4 總黃酮對(duì)總還原力的測(cè)定試驗(yàn) 分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL樣液，用蒸餾水調(diào)到 1 mL。加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液和2.5 mL 0.22 mol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)30 min，迅速冷卻加入2.5 mL 10%三氯乙酸，在4 000 r/min下離心10 min。最后取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水和2.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，在700 nm處測(cè)定吸光度。以維生素C作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 超聲波頻率對(duì)普通油茶總黃酮得率的影響 以超聲頻率[高頻（61 kHz）和低頻（35 kHz）]為變量，1 g ∶20 mL 料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、180 W超聲功率、40 ℃提取溫度、30 min提取時(shí)間為定量，通過測(cè)定提取液供試品的吸光度并計(jì)算總黃酮得率。如圖1所示，低頻（35 kHz）條件下總黃酮得率明顯優(yōu)于高頻（61 kHz），達(dá)到4.26%。

2.1.2 料液比對(duì)普通油茶總黃酮得率的影響 以料液比[1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL、1 g ∶60 mL]為變量，超聲低頻（35 kHz）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、180 W超聲功率、40 ℃提取溫度、30 min 提取時(shí)間為定量，通過測(cè)定提取液供試品的吸光度并計(jì)算總黃酮得率。如圖2所示，料液比在 1 g ∶50 mL 時(shí)，總黃酮得率最高，達(dá)到5.24%。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)普通油茶總黃酮得率的影響 以乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、40%、60%、80%、100%）為變量，超聲低頻（35 kHz）、1 g ∶20 mL料液比、180 W 超聲功率、40 ℃提取溫度、30 min提取時(shí)間為定量，通過測(cè)定提取液供試品的吸光度并計(jì)算總黃酮得率。如圖3所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%時(shí)，總黃酮得率最高，達(dá)到4.57%。

2.1.4 超聲波功率對(duì)普通油茶總黃酮得率的影響 以超聲功率（60、180、300、420、540 W）為變量，超聲低頻（35 kHz）、1 g ∶20 mL料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、40 ℃提取溫度、30 min提取時(shí)間為定量，通過測(cè)定提取液供試品的吸光度并計(jì)算總黃酮得率。如圖4所示，超聲功率在420 W時(shí)，總黃酮得率最高，達(dá)到4.03%。

2.1.5 提取溫度對(duì)普通油茶總黃酮得率的影響 以提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）為變量，超聲低頻（35 kHz）、1 g ∶20 mL料液比、180 W超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、30 min提取時(shí)間為定量，通過測(cè)定提取液供試品的吸光度并計(jì)算總黃酮得率。如圖5所示，提取溫度在60 ℃時(shí)，總黃酮得率最高，達(dá)到4.50%。

2.1.6 提取時(shí)間對(duì)普通油茶總黃酮得率的影響 以提取時(shí)間（10、30、50、70、90 min）為變量，超聲低頻（35 kHz）、1 g ∶20 mL料液比、180 W超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、40 ℃提取溫度為定量，通過測(cè)定提取液供試品的吸光度并計(jì)算總黃酮得率。如圖6所示，提取時(shí)間在30 min時(shí)，總黃酮得率最高，達(dá)到4.63%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)表 2設(shè)定的水平和因素，共設(shè)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中 24個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)。得到各個(gè)試驗(yàn)條件的總黃酮得率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立與分析 采用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到普通油茶葉片總黃酮得率（Y）對(duì)料液比（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）的二次多項(xiàng)回歸模型方程為Y=4.770 0+0.061 0A+0.120 0B+0.310 0C+0.220 0D-0.037 0AB+0.120 0AC-0.057 0AD-0.078 0BC+0.002 4BD-0.049 0CD-0.240 0A2-0.160 0B2-0.410 0C2-0.260 0D2，式中：Y為普通油茶葉片總黃酮得率的預(yù)測(cè)值。

從表3可以看出，失擬誤差不顯著;該回歸模型的P<0.000 1，說明本試驗(yàn)所采用的二次模型是極顯著的。料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間的單項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)AC都對(duì)油茶葉片黃酮得率有極顯著影響;預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.98 4，調(diào)整系數(shù)R2Adj為0.968，也表明試驗(yàn)的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值擬合度比較好。說明該模型能解釋96.8%響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，用該模型分析和預(yù)測(cè)油茶葉片黃酮的提取是合適的[9]。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 通過采用Design Expert 8.0.6軟件，將AB、AC、AD、BC、BD、CD交互進(jìn)行分析比較，做出響應(yīng)面曲面圖（圖7）。由這6組響應(yīng)面曲面圖可知，當(dāng)各因素的水平從-1至1增大過程，先是在一定范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值不斷增大;然后響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)，再隨著各因素的值繼續(xù)增大，其響應(yīng)值不斷減小。高線圖的中心點(diǎn)在3D圖上的投影即最高點(diǎn)，表明該點(diǎn)的提取率最高。這6組圖都反映出每個(gè)響應(yīng)曲面呈現(xiàn)開口向下的凸面形狀。

2.2.4 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn) 依據(jù)以上響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃徒Y(jié)果分析，料液比為1 g ∶51.5 mL，超聲功率為452.4 W，提取溫度為63.5 ℃，提取時(shí)間為 37.2 min 時(shí)為最佳條件，在最佳提取條件下普通油茶葉中總黃酮的提取率為4.88%。在此最佳條件下，將平行驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次，可得普通油茶葉片總黃酮的提取率平均值為4.96%。實(shí)際所測(cè)得的提取率的平均值比預(yù)測(cè)值增加0.076%，表明預(yù)測(cè)模型的可靠性較高。

2.3 5種山茶科植物葉片的總黃酮得率比較

在以上最佳提取條件下，對(duì)普通油茶、博白大果油茶、宛田紅花油茶、金花茶、大果石筆木等5種植物葉片的總黃酮得率進(jìn)行比較。結(jié)果（圖8）表明，同一條件下博白大果油茶葉片總黃酮的得率（8.67%）最高，是最低的大果石筆木得率（0.48%）的18倍，其次較高的是宛田紅花油茶（6.97%）和普通油茶（4.96%），金花茶（1.64%）較低。

2.4 體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 總黃酮對(duì)·OH的清除作用 由圖9可知，隨著加入植物樣液或維生素C溶液體積的增加，即濃度越大，對(duì)·OH的清除率不斷增強(qiáng)。不同濃度下，博白大果油茶和宛田紅花油茶對(duì)·OH的清除率都大于維生素C。在加入樣液為1.0 mL時(shí)，清除率表現(xiàn)為博白大果油茶>普通油茶>宛田紅花油茶>維生素C>金花茶>大果石筆木。

2.4.2 總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用 由圖10可知，在同體積（2 mL）樣液下，這5種植物樣液黃酮對(duì)DPPH·的清除率都低于維生素C。清除率表現(xiàn)為維生素C>博白大果油茶>宛田紅花油茶>金花茶>普通油茶>大果石筆木。

2.4.3 總黃酮對(duì)O-2·的清除作用 由圖11可知，隨著加入樣液或加入維生素C溶液體積的不斷增加，即濃度越大，對(duì)O-2·的清除率也不斷增強(qiáng)。普通油茶樣液對(duì)O-2·的清除率明顯高于維生素C，而且，隨樣液體積增加普通油茶對(duì)O-2·的清除率明顯提高。當(dāng)體積為1.0 mL時(shí)，普通油茶的清除率可達(dá)到88.4%，對(duì)O-2·的清除作用表現(xiàn)為普通油茶>維生素C>博白大果油茶>宛田紅花油茶>金花茶>大果石筆木。

2.4.4 總還原力的測(cè)定 由圖12可知，隨著加入樣液或維生素C液體積的不斷增加，即濃度越大，總還原力不斷增強(qiáng)。在樣液體積達(dá)到1.0 mL時(shí)，總還原力表現(xiàn)為普通油茶>宛田紅花油茶>博白大果油茶>維生素C>金花茶>大果石筆木。

3 結(jié)論

超聲波輔助提取茶葉中的總黃酮與傳統(tǒng)的醇提法相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。一方面可以通過空化作用破壞茶葉細(xì)胞明顯提高總黃酮得率，另一方面可以在室溫下進(jìn)行，方法簡(jiǎn)單易行，所用時(shí)間周期短，利于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用超聲波輔助提取普通油茶總黃酮，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，獲得的最優(yōu)提取工藝條件為超聲波低頻（35 kHz），乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，料液比為1 g ∶51.5 mL，超聲功率為452.4 W，提取溫度為63.5 ℃，提取時(shí)間為37.2 min，普通油茶總黃酮得率預(yù)測(cè)值為4.88%。在最佳提取條件下測(cè)定5種山茶科植物葉片總黃酮得率，并比較得出：博白大果油茶（8.67%）>宛田紅花油茶（6.97%）>普通油茶（4.96%）>金花茶（1.64%）>大果石筆木（0.48%）。植物體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，隨加入樣液體積增加，不同植物對(duì)·OH、DPPH·和O-2·的清除率和總還原力都明顯增強(qiáng)。在加入同體積1 mL樣液時(shí)，博白大果油茶、普通油茶和宛田紅花油茶對(duì)·OH的清除作用都優(yōu)于維生素C;普通油茶對(duì)O-2·的清除作用效果最好;普通油茶、宛田紅花油茶和博白大果油茶的總還原力都強(qiáng)于維生素C。在同體積（2 mL）樣液時(shí)，5種植物對(duì)DPPH·的清除率都不及維生素C，但博白大果油茶、宛田紅花油茶以及金花茶的清除率也都達(dá)到90%以上。

本研究通過測(cè)定并比較5種山茶科植物葉片總黃酮得率以及體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)普通油茶、博白大果油茶以及宛田紅花油茶的總黃酮得率都較高，且抗氧化活性也都明顯較好，這3種植物葉片都較適合作為黃酮提取的工業(yè)原料。由于普通油茶在野外資源更豐富，在規(guī)模化種植上也更常見，因此普通油茶比博白大果油茶和宛田紅花油茶更適合作為生產(chǎn)具有抗氧化保健茶產(chǎn)品的原料。

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