艾中偉 李興江 董海影 明玥 沈博
【摘要】目的:探討甲狀腺乳頭狀癌患者中BRAF-V600E基因突變的表達情況。方法:選擇2015年1月-2020年12月期間齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心病理診斷為橋本氏甲狀腺炎并發(fā)甲狀腺乳頭狀癌(HT-PTC)、橋本氏甲狀腺炎(HT)以及甲狀腺乳頭狀癌(PTC)患者共135例為研究對象,均行BRAF V600E基因突變檢測,對BRAF V600E基因突變與HT-PTC臨床病理特征的關(guān)系進行分析。結(jié)果:與PTC組和HT組相比,HT-PTC組的BRAF-V600E突變率較高,組間對比差異明顯(P<0.05),并且PTC組的BRAF-V600E突變率高于HT組(P<0.05);HT-PTC組的PD-1/PD-L1、ERK、MEK以及KRT19陽性率均高于HT組和PTC組(P<0.05);同時,BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預(yù)后、腫瘤分期以及年齡有關(guān)(P<0.05),但是與發(fā)病部位、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論:BRAF V600E突變是女性橋本氏甲狀腺炎發(fā)生甲狀腺乳頭狀癌的一個重要誘因,并且與腫瘤分期和年齡有關(guān),也是對HT-PTC患者預(yù)后進行判斷的一個獨立因素。
【關(guān)鍵詞】甲狀腺乳頭狀癌;BRAF-V600E基因突變;橋本氏甲狀腺炎;病理特征
甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是比較常見的一種內(nèi)分泌惡性腫瘤,其預(yù)后較好,術(shù)后10年生存率超過90%,但是一些PTC具有較強的侵襲性,容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),不僅影響患者預(yù)后,也是導(dǎo)致患者死亡的一個重要原因。近年來,在關(guān)于甲狀腺癌的分子機制研究中,發(fā)現(xiàn)鼠類肉瘤濾過性毒菌(v-Raf)致癌同源體B1(BRAF)基因突變是比較重要的一個因素,BRAF-V600基因突變在PTC患者中的發(fā)生率為28%-83%,但是在甲狀腺良性病變組織和正常組織中均未出現(xiàn)。有文獻報道,PTC患者同時往往伴有橋本氏甲狀腺炎(HT),因此明確橋本氏甲狀腺炎與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系,確定橋本氏甲狀腺炎是乳頭狀癌的原因,還是結(jié)果,對于甲狀腺乳頭癌的預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。因此,本文探討了BRAF V600E基因突變與橋本氏甲狀腺炎-甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系,現(xiàn)報告如下。
資料和方法
1.1一般資料
選擇2015年1月-2020年12月期間齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心病理診斷為橋本氏甲狀腺炎并發(fā)甲狀腺乳頭狀癌(HT-PTC)、橋本氏甲狀腺炎(HT)以及甲狀腺乳頭狀癌(PTC)患者共135例為研究對象,年齡22-78歲,平均(49.5±8.4)歲,其中55例為HT,40例為PTC,40例為HT-PTC。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床資料完善,且行BRAF-V600E基因檢測;(2)腫瘤直徑大小合適;(3)無其他癌癥病史及放療或化療史,無吸煙史;(4)術(shù)后病理診斷明確;(5)無甲狀腺、頸部淋巴結(jié)病史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)病理診斷不明確,或者未行頸淋巴結(jié)清掃術(shù);(2)未行BRAF-V600E基因檢測;(3)腫瘤直徑過大,不能明確其準(zhǔn)確位置;(4)合并其他惡性腫瘤;(5)吸煙史、頭頸部化療以及放療史;(6)甲狀腺或頸部淋巴結(jié)病史。
1.2方法
1.2.1實時定量PCR檢測
運用經(jīng)典Trizol-氯仿法提取組織總RNA,瓊脂糖電泳檢測RNA完整性,紫外分光光度法測定RNA的濃度及純度。取1μg總RNA,在20μL反應(yīng)體系中用oligo(d)T引物和SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得cDNA產(chǎn)物。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的相應(yīng)基因cDNA序列,用Primer Express Software v2.0設(shè)計特異SYBR Green Real-time PCR引物。以cDNA作為模板,在ABI 7000熒光定量PCR儀上的96孔板中用SYBR Green嵌合熒光法進行實時定量PCR反應(yīng)。mRNA相對表達水平計算公式為2-△△CT,其中△△CT=(CT目的基因- CT看家基因)實驗組-(CT目的基因- CT看家基因)對照組。
1.2.2檢測KRT19蛋白表達
運用Western blot分析KRT19蛋白表達。采用蛋白提取試劑盒分別提取組織蛋白。將提取蛋白加200μL上樣緩沖液,煮沸10 min,室溫放置20 min溶解沉淀,置-80℃保存?zhèn)溆?。用BCA法檢測樣品蛋白質(zhì)濃度后,取50μg蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2h分離。膠中蛋白質(zhì)在70mA恒流狀態(tài)下4℃過夜電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。膜在5%脫脂奶粉37℃封閉2h。將兔抗小鼠一抗與硝酸纖維素膜4℃培育過夜。與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 37℃溫預(yù)1h。用Western印跡熒光發(fā)光檢測試劑盒發(fā)光、壓片,應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)分析測定各組條帶的積分光密度。同時,檢測KRT19 mRNA,方法與上述基本一致。
1.2.3檢測PD-1/PD-L1表達水平
借助免疫組化(SP三步法)染色法對腫瘤與黏膜組織內(nèi)PD-L1表達水平進行測定。每次進行免疫組化時均用 PBS 代替一抗作陰性對照,以排除非特異性結(jié)合。37℃溫水展片,1%多聚賴氨酸涂片,自然干燥,組織切片覆片,6℃烤片過夜,經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各 10min,無水乙醇及 95%、85%、75%乙醇各2min 浸泡后,自來水沖洗 2~3min,微波高火抗原修復(fù),孵育 10min,封閉,加一抗和二抗,滴加 HRP 標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,DAB 顯色,蘇木素復(fù)染,封片,拍照。
1.2.4檢測MEK/ERK表達
采用實時定量PCR和Western blot檢測MEK和ERK的表達,方法同上。同時采用免疫熒光法檢測MEK/ERK蛋白表達及磷酸化水平。組織塊放入液氮罐內(nèi)速凍5min,將其取出后應(yīng)用冰凍切片機進行冰凍切片,片厚20μm,切片經(jīng)0.01M PBS清洗,與一抗4℃孵育過夜,0.01M PBS清洗,F(xiàn)ITC標(biāo)記熒光二抗1:1000,避光孵育1.5h,甘油封片。在熒光顯微鏡和圖像處理系統(tǒng)上進行熒光顯微成像。應(yīng)用ImageJ軟件計算熒光強度。
1.3觀察指標(biāo)
統(tǒng)計三組的KRT19、MEK、ERK、PD-1/PD-L1以及BRAF-V600E陽性率,收集PTC的臨床病理學(xué)特征,包括腫瘤預(yù)后、發(fā)病部位、腫瘤分期、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移區(qū)域、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小以及年齡,并且分析BRAF-V600E突變與PTC病理學(xué)特征之間的相關(guān)性。
1.4統(tǒng)計學(xué)分析
由SPSS20.0軟件分析,其中計數(shù)資料由百分率(%)表示,組間比較行X2檢驗,運用t檢驗計量資料對比,以P<0.05表示有差異。
結(jié)果
2.1三組BRAF-V600E突變率比較
HT-PTC組、PTC組以及HT組的BRAF-V600E突變率分別為67.5%(27/40)、47.5%(19/40)、1.82%(1/55),組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
2.2三組MEK、ERK、PD-1/PD-L1以及KRT19陽性率對比
與PTC組和HT組相比,HT-PTC組的MEK、PD-1/PD-L1、KRT19以及ERK陽性率均較高,組間對比有差異(P<0.05),見表1。
2.3HT-PTC臨床病理學(xué)特征與BRAF V600基因突變之間的關(guān)系
BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預(yù)后、腫瘤分期以及年齡有關(guān)(P<0.05),但是與發(fā)病部位、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05),見表2。
討論
PTC是比較常見的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,具有復(fù)雜的發(fā)病機制,與基因突變、免疫功能紊亂以及內(nèi)分泌失調(diào)等諸多因素有關(guān)。有文獻報道,HT合并PTC具有較高的發(fā)病率,約為55%-60%,提示癌變的發(fā)生和發(fā)展與HT密切相關(guān)。HT作為自身免疫性的一種甲狀腺疾病,以體內(nèi)出現(xiàn)特異性甲狀腺抗體為主要表現(xiàn),因為漿細胞和淋巴細胞浸潤,可破壞甲狀腺組織結(jié)構(gòu),從而降低甲狀腺功能。而BRAF基因是比較重要的一個原癌基因,位于人類7號染色體上,編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,也是MAPK/ERK信號通路的一個關(guān)鍵分子,與黑色素瘤、非小細胞肺癌、結(jié)腸癌以及PTC等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在甲狀腺其他腫瘤中,BRAF-V600E發(fā)生突變較少,僅出現(xiàn)在PTC中,提示BRAF-V600E基因突變是診斷PTC的一個特異性標(biāo)志物。也有文獻報道,PTC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及侵襲性與BRAF-V600E位點的突變有關(guān),不僅能夠誘發(fā)正常的甲狀腺濾泡細胞腫瘤,還可以促進和維持PTC的侵襲性。在本次研究中,HT-PTC的BRAF V600E突變率高于PTC組和HT組(P<0.05),其中HT組中僅有1例突變,與國內(nèi)外研究報道基本一致,說明HT是否出現(xiàn)癌變與BRAF-V600E突變有關(guān),并且BRAF-V600E也是導(dǎo)致HT癌變的一個重要危險因素。同時,BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預(yù)后、腫瘤分期以及年齡有關(guān),提示這一基因位點不僅有助于鑒別甲狀腺良惡性腫瘤,還能判斷患者預(yù)后。
綜上所述,BRAF V600E突變是女性橋本氏甲狀腺炎發(fā)生甲狀腺乳頭狀癌的一個重要誘因,并且與腫瘤分期和年齡有關(guān),也是對HT-PTC患者預(yù)后進行判斷的一個獨立因素。
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