乙型肝炎病毒(HBV)是引起肝硬化和肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一

。最近有研究顯示，HBV可以觸發(fā)自噬途徑，通過(guò)該途徑病毒可以被激活以促進(jìn)HBV DNA復(fù)制

，因此在HBV感染中，早期自噬有利于HBV復(fù)制。而當(dāng)疾病進(jìn)展為肝癌時(shí)，激活的自噬可通過(guò)細(xì)胞自噬性死亡程序和抗腫瘤免疫反應(yīng)來(lái)延緩腫瘤進(jìn)展

。因此，自噬有望成為病毒感染及其相關(guān)疾病的一個(gè)重要而新穎的靶點(diǎn)。由于其在許多生物過(guò)程中的重要作用，非編碼RNA(ncRNAs)越來(lái)越受到關(guān)注。然而微小RNA(miRNAs)并不獨(dú)立參與生理和病理過(guò)程。相反，長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNAs)通過(guò)miRNAs最終調(diào)節(jié)靶mRNA水平。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，lncRNA核富集轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)含有miR-29b的靶位點(diǎn)，miR-29b同樣含有自噬相關(guān)基因9a(ATG-9a)的互補(bǔ)序列。有研究顯示miR-29b在HBV感染相關(guān)疾病中呈低表達(dá)

，然而，NEAT1是否在HBV感染中調(diào)節(jié)miR-29b進(jìn)而影響自噬過(guò)程尚不清楚。本研究擬檢測(cè)HBV感染相關(guān)肝臟疾病患者血清NEAT1、miR-29b以及ATG-9a蛋白表達(dá)差異，為深入認(rèn)識(shí)HBV感染性疾病的進(jìn)展機(jī)制提供一定的臨床證據(jù)支持。

(3)L1層各弧段的距離誤差完成后,可選取最小距離誤差及其匹配弧段繼續(xù)分段構(gòu)成L2層搜索弧段,但事實(shí)上最優(yōu)解并不一定位于最小距離誤差弧段的內(nèi)部,而是可能落于兩相鄰弧段中點(diǎn)所限定的區(qū)域的任意位置(圖3左側(cè)高度弧實(shí)線所夾區(qū)域);對(duì)于邊緣弧段則是弧線端點(diǎn)與相鄰弧段中點(diǎn)所限定的區(qū)域(圖3右側(cè))。故為避免遺漏最優(yōu)解,在此保留該區(qū)域,將其等分為2N份(邊緣區(qū)域分為1.5N份)構(gòu)成L2層搜索弧段,并刪除剩余區(qū)域以大幅減少運(yùn)算量,重復(fù)步驟(2)搜索最小誤差弧段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究共納入我院2018年1月至2020年3月收治的120例初次確診的HBV相關(guān)肝臟疾病患者。所有患者均為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性和/或HBV DNA陽(yáng)性6個(gè)月以上者，包括42例慢性乙型肝炎(CHB)、38例肝硬化(Cirr)、40例肝細(xì)胞癌(HCC)。診斷符合相關(guān)學(xué)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)

。另外采集30例健康志愿者的血液樣本作為對(duì)照。4組受試者臨床資料見表1。排除標(biāo)準(zhǔn)：①與人類免疫缺陷病毒(HIV)共感染的患者；②丙型肝炎病毒(HCV)感染、藥物攝入、飲酒和自身免疫性肝炎等原因引起的肝損傷患者；③患有嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病者；④妊娠或哺乳人群。所有參與研究的患者均獲得書面知情同意書。整個(gè)研究根據(jù)《赫爾辛基宣言》進(jìn)行，并得到我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 觀察指標(biāo) 測(cè)定各組受試者肝功能指標(biāo)，包括總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)；PL

=血小板/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)；NL

=中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)；檢測(cè)HBsAg滴度。采用熒光定量PCR方法檢測(cè)lncRNA NEAT1和miR-29b的相對(duì)表達(dá)量。測(cè)定各組受試者血清ATG-9a水平。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因分析 合成含有miR-29b結(jié)合位點(diǎn)的ATG-9a基因野生型3'UTR序列(ATG-9a WT)和突變體ATG-9a序列(ATG-9a MUT)，并克隆到pmirGLO載體(美國(guó)Promega公司)中。將HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，然后轉(zhuǎn)染pmirGLO-ATG9a WT或pmirGLO-ATG9a MUT，然后用LipoFiter 3.0TM將50 nmol/L miR-29b模擬物或模擬NC共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)測(cè)量相對(duì)熒光素酶活性。另外，由Sangon生物技術(shù)公司合成含有miR-29b結(jié)合位點(diǎn)的NEAT1野生型序列(NEAT1 WT)和該序列的突變體(NEAT1 MUT)，并將其插入pmirGLO載體，分析lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a靶向調(diào)控關(guān)系。

2.4 3組患者血清lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a水平與HBV DNA病毒載量的關(guān)系 CHB組、Cirr組、HCC組患者HBV DNA病毒載量分別為(2.24±1.34)copies/ml、(3.52±1.65)copies/ml、(3.53±2.12)copies/ml，Cirr組、HCC組患者HBV DNA病毒載量高于CHB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

<0.05)；而Cirr組和HCC組患者HBV DNA病毒載量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

>0.05)。經(jīng)Pearson法分析，CHB組、Cirr組、HCC組患者血清lncRNA NEAT1、ATG-9a水平與HBV DNA病毒載量呈正相關(guān)性(

=0.798，0.834，均

<0.001)；而血清miR-29b相對(duì)表達(dá)量與HBV DNA病毒載量呈負(fù)相關(guān)性(

=-0.733，

<0.001)，見圖3。

2 結(jié)果

2.5 3組患者血清lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a水平與PLR、NLR的關(guān)系 經(jīng)Pearson法分析，CHB組、Cirr組、HCC組患者血清lncRNA NEAT1、ATG-9a水平與PLR(

=0.464，0.512，均

<0.001)和NLR(

=0.646，0.705，均

<0.001)呈正相關(guān)性；而血清miR-29b相對(duì)表達(dá)量與PLR(

=-0.481，

<0.001)和NLR(

=-0.608，

<0.001)呈負(fù)相關(guān)性，見圖4。

分類器是一種利用已知的觀察數(shù)據(jù)（測(cè)試數(shù)據(jù)或?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)）構(gòu)建的分類模型，并以此來(lái)預(yù)測(cè)未知類別的對(duì)象所屬類別。常見的基分類器包括線性回歸，決策樹，基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的分類，貝葉斯信念網(wǎng)絡(luò)，向后傳播，支持向量機(jī)（SVM）等方法，其中包括ID3及其改進(jìn)算法C4.5，分類回歸樹CART，基于頻繁模式的CBA、CMAR、CPAR 等算法[8，9]。

2.3 雙熒光素酶基因報(bào)告分析lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a靶向調(diào)控關(guān)系 為了揭示lncRNA NEAT1和miR-29b對(duì)自噬的調(diào)控作用，利用TargetScan (http://www.targetscan.org)和StarBase (https://starbase.sysu.edu.cn/targetSite.php)預(yù)測(cè)，確定ATG-9a是miR-29b的靶標(biāo)，而且NEAT1也存在與miR-29b互補(bǔ)序列。為了證實(shí)這一預(yù)測(cè)，我們利用HEK293細(xì)胞進(jìn)行了熒光報(bào)告分析。結(jié)果表明，miR-29b mimics降低了ATG-9a-3’UTR-WT的熒光強(qiáng)度，而對(duì)ATG-9a-3’UTR-MUT沒(méi)有顯著影響。同樣miR-29b mimics降低了NEAT1-3’UTR-WT的熒光素酶活性，見圖2。

基于以上討論，本文重點(diǎn)考慮抗滑樁受荷段底端的土拱跨中前緣M點(diǎn)的三向應(yīng)力狀態(tài)。其中，M點(diǎn)水平面內(nèi)的應(yīng)力為σx和σy，σx為樁后土拱拱頂處的軸向壓應(yīng)力，σy為樁側(cè)土拱對(duì)樁后土拱的反力，豎向應(yīng)力σz可由受荷段底端的土體自重應(yīng)力算出，因此，M點(diǎn)三向應(yīng)力表達(dá)式為：

2.2 3組患者血清miR-296與lncRA NEAT1和ATG-9a水平的關(guān)系 經(jīng)Pearson法分析，CHB組、Cirr組、HCC組患者血清lncRNA NEAT1與miR-29b相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性(

=-0.755，

<0.001)，miR-29b與ATG-9a相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性(

=-0.835，

<0.001)見圖1。

2.1 4組受試者血清lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a水平檢測(cè)結(jié)果 見表2。

3 討論

自噬是真核細(xì)胞體內(nèi)一種進(jìn)化上高度保守的膜系統(tǒng)，它能吞噬長(zhǎng)壽命的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器并保持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)

。自噬的進(jìn)展始于自噬相關(guān)基因(ATG)的激活，在Beclin-1(BECN1)-Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)復(fù)合物和輕鏈3(LC3)脂肪酶作用下形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，通過(guò)與溶酶體對(duì)接和融合來(lái)完成自噬過(guò)程

。自噬誘導(dǎo)或激活的關(guān)鍵過(guò)程是形成完整的雙膜結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可吞噬有故障的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，并隨后通過(guò)與溶酶體融合將其降解

。在關(guān)鍵的自噬相關(guān)蛋白質(zhì)中，ATG-9a在自噬體的組裝和隨后的自噬激活中起著關(guān)鍵作用

。研究表明，ATG-9a基因缺陷會(huì)影響自噬過(guò)程的啟動(dòng)，并影響HBV病毒復(fù)制過(guò)程

。也有報(bào)道稱，HBV在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)自噬

。在本研究中，隨著HBV DNA病毒載量增加，HBV感染相關(guān)肝臟疾病患者血清ATG-9a蛋白水平也相應(yīng)增加，提示早期自噬有利于HBV的復(fù)制，從而加重肝臟感染程度。自噬在HBV正常生命周期中發(fā)揮著重要作用，如HBV包膜，已逐漸被很多研究所證實(shí)

。HBV可以觸發(fā)自噬途徑，通過(guò)自噬途徑，病毒可被激活以促進(jìn)其DNA復(fù)制。

HBV是一種具有高傳染性、嚴(yán)格的嗜肝性DNA病毒，現(xiàn)有治療藥物的耐藥性和副作用不容忽視

。本研究結(jié)果提示，lncRNA NEAT1/miR-29b/ATG-9a軸與HBV DNA病毒載量以及系統(tǒng)炎癥指標(biāo)PLR、NLR密切相關(guān)。隨著HBV感染相關(guān)肝臟疾病的進(jìn)展，自噬過(guò)程被激活，而且HBV可利用自噬系統(tǒng)的元素進(jìn)行病毒復(fù)制。

The general form of surface potential ψsλ(y) in GSGCDMT-SON MOSFET can be obtained by solving the second order differential equation given in Eq. (11). Its solution is given as

然而，HCC與HBV誘導(dǎo)的自噬關(guān)系更加復(fù)雜。當(dāng)疾病進(jìn)展為肝癌時(shí)，激活的自噬可通過(guò)自噬細(xì)胞死亡和抗腫瘤免疫反應(yīng)來(lái)減弱腫瘤進(jìn)展。在HBV轉(zhuǎn)基因肝腫瘤小鼠模型和人類HBV誘導(dǎo)的HCC標(biāo)本中ATG表達(dá)有所下調(diào)

；而且在BECLIN1-/-模型小鼠中，HCC進(jìn)程加快

。上述數(shù)據(jù)表明在肝細(xì)胞癌變?cè)缙?，?xì)胞自噬處于較低水平，因此在本研究中，雖然HCC患者PLR、NLR等系統(tǒng)性炎癥指標(biāo)較CHB和Cirr患者進(jìn)一步升高，但是HBV-HCC患者血清lncRNA NEAT1、miR-29b、ATG-9a相對(duì)表達(dá)量與HBV-Cirr患者相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

miRNAs通過(guò)靶向編碼mRNAs的3'-UTR誘導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA翻譯。miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，它們都有相同的種子區(qū)，在肝臟疾病中普遍下調(diào)

。我們通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，ATG-9a是miR-29b的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。但miRNAs不獨(dú)立參與生理和病理過(guò)程，一般受到lncRNAs的調(diào)控。因此我們進(jìn)一步通過(guò)StarBase軟件預(yù)測(cè)，NEAT1含有miR-29b的靶位點(diǎn)。本研究結(jié)果提示lncRNA NEAT1/miR-29b/ATG-9a生物軸參與HBV病毒復(fù)制過(guò)程，而且與HBV感染引起的慢性炎癥損傷密切相關(guān)。

綜上所述，在HBV感染相關(guān)疾病進(jìn)展中，HBV通過(guò)lncRNA NEAT1/miR-29b/ATG-9a生物軸誘導(dǎo)自噬進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制，并且加重肝臟炎癥損傷；在CHB發(fā)展至Cirr過(guò)程中，自噬活性增強(qiáng)，導(dǎo)致HBV DNA復(fù)制增加，病毒活躍，肝功能逐漸降低，但是發(fā)生癌變時(shí)，可能由于其他促癌基因的介入或者超過(guò)自噬的正常生理范圍導(dǎo)致該通路活性降低，自噬被抑制，但是肝臟組織炎癥損傷則進(jìn)一步加重。

[1] 張維蘭,羅和生.湖北地區(qū)肝硬化病因及相關(guān)分析[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2019,28(3):325-329.

[2] Zhang L.Autophagy in hepatitis B or C virus infection:An incubator and a potential therapeutic target[J].Life Sci,2020,242(2):117206.

[3] Xie M,Yang Z,Liu Y,

. The role of HBV-induced autophagy in HBV replication and HBV related-HCC[J].Life Sci,2018,205(7):107-112.

[4] Kunanopparat A,Kimkong I,Palaga T,

.Increased ATG5-ATG12 in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma and their role in apoptosis[J].World J Gastroenterol, 2016,22(37):8361-8374.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)[J].臨床肝膽病雜志，2015，31(12)：1940-1960.

[6] 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)消化系統(tǒng)專業(yè)委員會(huì).肝硬化中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)[J].中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2011，19(4):277-279.

[7] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)政醫(yī)管局，原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)[J].中華消化外科雜志，2017，16(7):635.

[8] 謝曉,陸倫根.乙型肝炎肝硬化抗病毒治療的進(jìn)展[J].實(shí)用肝臟病雜志,2018,21(1):140-144.

[9] 彭佳麗,賴欣,韋嘉,等.自噬在HBV及相關(guān)肝臟疾病中的雙重作用[J].臨床肝膽病雜志,2018,34(10):2217-2220.

[10] 羅羽鷗,楊曉玲,李川,等.HBV-ACLF患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ的表達(dá)水平及其臨床意義[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2020,27(4):586-590.

[11] Khabir M,Aliche AZ,Sureau C,

. Hepatitis delta virus alters the autophagy process to promote its genome replication[J].J Virol,2020,94(4):e01936-19.

[12] Imai K, Hao F, Fujita N,

. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation[J].J Cell Sci,2016,129(20):3781-3791.

[13] Kim SJ,Khan M,Quan J,

. Hepatitis B virus disrupts mitochondrial dynamics: induces fission and mitophagy to attenuate apopto-sis[J].PLoS Pathog,2013,9(12):e1003722.

[14] 郭海清,陳亞利,段鐘平,等.細(xì)胞自噬與肝炎病毒感染的相關(guān)性研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2015,24(4):381-384.

[15] Wu SY,Lan SH,Liu HS.Autophagy and microRNA in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol,2016,22(1):176-87.

[16] 王陽(yáng),車陽(yáng),高玉雪,等. 自噬相關(guān)基因Atg7的表達(dá)對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2020,17(2):4-8.

[17] Wang J,Chen J,Liu Y,

. Hepatitis B virus induces autophagy to promote its replication by the axis of miR-192-3p-XIAP through NF kappa B signaling[J].Hepatology,2019,69(3):974-992.

[18] 劉莉莉,蘇何玲,劉永明,等.microRNA在HBV感染相關(guān)疾病中的作用[J].臨床肝膽病雜志,2020,36(3):662-665.