摘要：目的 觀察溫敏型細(xì)胞培養(yǎng)皿生物學(xué)研究以及對于細(xì)胞生長指標(biāo)的影響，為貼壁型易損傷細(xì)胞在體外擴(kuò)增和細(xì)胞治療等醫(yī)療應(yīng)用方面提供安全依據(jù)。方法 采用內(nèi)毒素試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)觀察溫敏型細(xì)胞培養(yǎng)皿的生物安全性，另外通過細(xì)胞貼壁生長匯合度和細(xì)胞溫敏脫落率觀察溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿對于細(xì)胞生長的影響。結(jié)果 溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿在凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)條件中濃度小于0.25 EU/mL;在體外溶血試驗(yàn)中溶血率<5%;細(xì)胞毒性反應(yīng)級別為2級;細(xì)胞貼壁生長匯合度和細(xì)胞溫敏脫落率均>80%。

關(guān)鍵詞：溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿;醫(yī)療器械;內(nèi)毒素;溶血;細(xì)胞毒性

【中圖分類號】 R197.39 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）06--02

Abstract： Objective To observe the biological research of temperature-sensitive cell culture dish and its effect on cell growth indexes， and to provide a safe basis for the medical application of adherent vulnerable cells in vitro expansion and cell therapy. Methods Endotoxin test， hemolysis test and cytotoxicity test were used to observe the biosafety of temperature-sensitive cell culture dishes. In addition， the effect of temperature-sensitive cell culture dishes on cell growth was observed by cell adherent growth confluence and cell temperature-sensitive shedding rate. Results The concentration of temperature-sensitive cell culture dishes was less than 0.25 EU/mL in the gel method bacterial endotoxin test conditions; the hemolysis rate in the in vitro hemolysis test was less than 5%; the cytotoxic reaction grade was grade 2; Cell adherent growth confluence and cell temperature-sensitive shedding rate were both >80%.

Key words： Temperature-sensitive cell culture dish; Medical device; Endotoxin; Hemolysis; Cytotoxicity

隨著臨床治療的發(fā)展，一個新的治療方式——細(xì)胞治療，慢慢進(jìn)入人們視野。這種治療方式是在體外培養(yǎng)的健康干細(xì)胞，隨后移植到患者體內(nèi)，植入人體的健康干細(xì)胞通過自身的分化和增殖起到修復(fù)或替換人體原有的受損細(xì)胞或組織來達(dá)到治愈的目的。但是，干細(xì)胞本身十分脆弱，因此其在體外培養(yǎng)的條件也十分苛刻。為了保證干細(xì)胞在培養(yǎng)和傳代過程中盡可能保證完整性和減少損失，一般選用溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行體外干細(xì)胞的培養(yǎng)。溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿因?qū)囟让舾械奶匦?，其聚合物涂層能夠隨著外界溫度的變化將溫敏表面從疏水轉(zhuǎn)向親水，從而獲得具有高活力和完整表面蛋白的貼壁干細(xì)胞，避免細(xì)胞受外力或蛋白酶水解的損傷，并最大程度保留細(xì)胞表面蛋白。本研究通過對溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿的內(nèi)毒素含量、溶血率和細(xì)胞毒性[1]的生物學(xué)研究以及細(xì)胞貼壁生長匯合度和細(xì)胞溫敏脫落率的生長指標(biāo)研究，觀察溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿的性能，為其在醫(yī)療器械制造以及應(yīng)用方面提供安全依據(jù)和建議。

1.材料與方法

1.1材料 小鼠成纖維細(xì)胞 L-929（美國菌種保存中心（ATCC）），細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水（湛江博康海洋生物有限公司），鱟試劑（TAL，靈敏度0.25 EU/mL，規(guī)格0.1mL）（湛江博康海洋生物有限公司），細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品15EU/支（湛江博康海洋生物有限公司），MEM培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（Clark），青鏈霉素（Gibco），胰蛋白酶（biosharp），PBS（Gibco），MTT（Solarbio），異丙醇（Rhawn），0.9 %氯化鈉注射液（廣西裕源藥業(yè)有限公司），高密度聚乙烯（Hatano Research Institute. FDSC），DMSO（Macklin）。

1.2儀器 電熱恒溫干燥箱（上海精宏），紫外分光光度計（INESA），CO2 培養(yǎng)箱（Thermofisher Scientific），電子天平（賽多利斯），恒溫水浴鍋（Crystal），潔凈工作臺（蘇凈安泰），低速自動平衡離心機(jī)（湖南湘儀），Multiskan? Sky酶標(biāo)儀（Thermofisher Scientific），倒置顯微鏡（含成像）（NIKON）、 立式單門雙層恒溫振蕩箱（Crystal）

1.3實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭兔3只，健康、初成年、雌性未產(chǎn)且無孕，試驗(yàn)初體重2.3～2.8 kg，來源于無錫恒泰實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2015-0004，每天供應(yīng)無錫恒泰實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限公司的實(shí)驗(yàn)兔全價顆粒飼料。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18-26 ℃，相對濕度30 %-70 %。

1.4方法

1.4.1內(nèi)毒素試驗(yàn) 將所有玻璃器皿和其他熱穩(wěn)定材料在250℃的溫度下脫熱至少30min去除外源性內(nèi)毒素，被測物品的內(nèi)毒素限值：L≤20EU/件，鱟試劑靈敏度：λ= 0.25 EU / mL，浸提介質(zhì)體積：V= L/ λ。取同批次3件樣品，將溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿在無菌內(nèi)毒素檢查用水中浸提，于37 ℃條件下孵育1小時。準(zhǔn)備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品2支，按《細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品使用說明書》配制2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液以及2λ測試樣品溶液。取12支0.1mL/支的鱟試劑，開瓶后先在每支安瓿瓶中各加入0.1mL檢查用水溶解鱟試劑粉末，之后三個平行樣品的每2支各加入0.1mL測試樣品浸提液作為測試樣品管（A），2支加入0.1mL含有2λ的測試樣品浸提液作為樣品陽性對照管（B），2支加入0.1mL含有2λ的檢查用水作為陽性對照管（C），2支加入0.1mL檢查用水作為陰性對照管（D）。將試管中液體輕輕混勻并用封口膜封閉管口，垂直放入37℃恒溫水浴鍋中。60分鐘后將試管輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°。若試管內(nèi)容物呈緊實(shí)凝膠，不變形，不從管壁滑脫為陽性，記錄為（+）;不呈凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫為陰性，記錄為（-）。在試驗(yàn)有效情況下，如果測試樣品管兩個平行管均為陰性，判定測試品內(nèi)毒素含量小于藥典規(guī)定限值。

1.4.2溶血試驗(yàn) 將溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿按照按照0.2 g/mL的比例浸沒在0.9%氯化鈉注射用水中，于37℃恒溫水浴鍋中浸提。新西蘭兔心臟采血10 mL至一次性使用真空采血管（EDTA-K2管）混勻，按照新鮮抗凝兔血：氯化鈉注射液為8mL：10mL比例稀釋。浸提結(jié)束后，每支試管內(nèi)按照10 mL浸提液：0.2 mL稀釋后的兔血比例加入稀釋后兔血，輕輕混勻，繼續(xù)放置于37℃水浴鍋中60分鐘。保溫結(jié)束后倒出管內(nèi)液體，以2500 rpm離心5分鐘，吸取上清液于比色杯中，空白比色杯調(diào)零，在545 nm波長處測定吸光度值，計算平均值和溶血率。溶血率% =（供試品組吸光度-陰性對照組吸光度）/（陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度）×100%。溶血率小于5%時判定合格。

1.4.3細(xì)胞毒性試驗(yàn) 全程在超凈臺內(nèi)操作，保證無菌操作過程。將溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿按照0.2 g/mL的比例浸沒在含血清的培養(yǎng)基中，于37 ℃浸提24小時。生長至對數(shù)生長期的L-929細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化，消化后將細(xì)胞懸浮液離心（1000 rpm，5分鐘），棄去上清，用MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)得到1×104個/mL 細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以每孔100 μL 接種于96孔板中，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2，>90%濕度）中培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待孵育24小時后棄去96孔板內(nèi)原培養(yǎng)基，在96孔板相應(yīng)孔內(nèi)各加入100 μL浸提液，空白對照（含血清培養(yǎng)基），陰性對照（按3cm2/mL浸提的高密度聚乙烯）和陽性對照（0.1% ZDEC）。將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每組設(shè)置六個復(fù)孔。培養(yǎng)72小時后取出96孔板，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，然后去除液體，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4小時后去除上清，每孔加入150 μL異丙醇溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測定570 nm和630 nm 波長下的吸光度值，計算其細(xì)胞毒性。細(xì)胞活力%=試驗(yàn)（或陰性及陽性）樣品組OD570 /空白對照組OD570×100%。根據(jù)表2分級標(biāo)準(zhǔn)判定。陰性對照組的級別應(yīng)≤1級，陽性對照組≥3級。供試品分級不大于2級時判定為合格。

1.4.4細(xì)胞貼壁生長匯合度試驗(yàn) 全程在超凈臺內(nèi)操作，保證無菌操作過程。生長至對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化，消化后將細(xì)胞懸浮液離心（1000 rpm，5分鐘），棄去上清，用MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)得到2×106個/mL 細(xì)胞懸液。接種10 mL細(xì)胞懸液至溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2，>90%濕度）中培養(yǎng)48小時，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度。

1.4.5細(xì)胞溫敏脫落率試驗(yàn) 取L-929細(xì)胞生長匯合度良好的溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于4℃冰箱，低溫放置20分鐘后用移液槍均勻吹打培養(yǎng)皿表面20次，收集脫落細(xì)胞并計算脫落細(xì)胞總數(shù)，再用胰酶消化培養(yǎng)皿中未脫落的細(xì)胞并計數(shù)。計算收獲細(xì)胞總量，并計算細(xì)胞脫落率。脫落率=/（溫敏脫落收獲的細(xì)胞數(shù)+胰酶消化收獲的細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)表示為mean±SD。

2. 結(jié)果

2.1細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn) 陰性對照管結(jié)果均為陰性，陽性對照管結(jié)果均為陽性、測試樣品陽性對照管結(jié)果均為陽性，測試樣品管結(jié)果均為陰性。在凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)條件中濃度小于0.25 EU/mL。

2.2溶血試驗(yàn) 陰性對照組吸光度平均值為0.004，陽性對照組吸光度平均值為0.601，測試樣品吸光度平均值為0.013，見表3，溶血率=（0.013-0.004）/（0.601-0.004）×100%=1.51%。因此試驗(yàn)樣品在體外溶血試驗(yàn)中溶血率<5%，無溶血反應(yīng)。

2.3細(xì)胞毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)樣品浸提液在與細(xì)胞接觸72小時后在顯微鏡下均可見胞漿內(nèi)離散穎粒，無細(xì)胞溶解和細(xì)胞增殖下降情況。細(xì)胞存活率分別為71.2%，細(xì)胞分級為2級，無潛在的細(xì)胞毒性，見表4。

2.4細(xì)胞貼壁生長匯合度試驗(yàn) L-929細(xì)胞在溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48小時后細(xì)胞形態(tài)完好，細(xì)胞匯合度大于80%。

2.5細(xì)胞溫敏脫落率試驗(yàn) 溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿在4℃冰箱放置20分鐘后用移液槍均勻吹落細(xì)胞總數(shù)為6.5×108個，用胰酶消化培養(yǎng)皿中未脫落的細(xì)胞總數(shù)為1.5×108個，因此脫落率=6.5×108個/（6.5×108個+1.5×108個）×100%=81.25%。

3. 討論

隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，通過體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行人體疾病治療的方法也逐漸成為一種新型的治療方式。這種治療方式對于神經(jīng)方面、免疫方面疾病以及其他內(nèi)科或外科疾病都有良好的治療效果，并且由于它的自我更新和多向分化的潛能[2]，在病人體內(nèi)也能起到造血支持和免疫調(diào)控的作用。但是干細(xì)胞非常脆弱，其在體外的培養(yǎng)通常會受到許多因素的影響，如干細(xì)胞生存所需的養(yǎng)分、培養(yǎng)基的pH值、培養(yǎng)環(huán)境的溫度、氧氣和二氧化碳的含量等。細(xì)胞制備作為細(xì)胞治療的重要環(huán)節(jié)，為了保證其在臨床治療上的有效性，必須盡可能從細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上收獲無損傷、高活性且功能完好的貼壁細(xì)胞。傳統(tǒng)的方式是利用胰蛋白酶進(jìn)行消化，但這種方式對于細(xì)胞治療來說存在很多缺點(diǎn)。由于胰蛋白酶會降解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞活力降低甚至某些功能的喪失[3，4]，最終影響臨床治療時細(xì)胞質(zhì)量。此外，胰蛋白酶的來源一般是動物衍生的蛋白質(zhì)，由于種屬的不同在治療時可能會存在疾病傳播風(fēng)險[5]。溫度作為對環(huán)境敏感的聚合物系統(tǒng)中使用最廣泛的一種刺激方式，相比于其他因素來說其變化更容易控制，因此溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿適合用于細(xì)胞的培養(yǎng)與收獲，避免了培養(yǎng)過程中細(xì)胞由于外力或蛋白水解的損傷，是目前最有應(yīng)用前景的細(xì)胞培養(yǎng)材料。溫敏性聚合物材料存在最低臨界溶解溫度[6]，當(dāng)溫度處在最低共溶溫度時溫敏性聚合物發(fā)生從無規(guī)卷曲形式到塌陷或球形形式的相變，溫敏表面從疏水轉(zhuǎn)向親水，而使貼壁細(xì)胞能夠輕易脫落，獲得表面蛋白完整且活力高的貼壁細(xì)胞。

宋克東[7]等發(fā)現(xiàn)在制備的溫敏性玻璃微載體上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠保持粘附并具有良好的生長曲線，降溫收獲細(xì)胞后再培養(yǎng)也能保持良好的生長活性。此外，溫敏型殼聚糖支架與誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞復(fù)合后不會影響干細(xì)胞表型和功能的變化，可作為干細(xì)胞植入的可注射性載體材料[8]。因此，利用溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿能夠滿足生物醫(yī)學(xué)和組織工程中對于高質(zhì)量細(xì)胞的需求。在本研究中也發(fā)現(xiàn)溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿在培養(yǎng)細(xì)胞過程中細(xì)胞生長匯合度良好，對細(xì)胞生長無不良影響，且能夠依據(jù)溫度變化收獲>80%的貼壁細(xì)胞，發(fā)揮其溫敏特性保持細(xì)胞的完整性。同時，作為細(xì)胞治療中的醫(yī)療器械，在生物學(xué)試驗(yàn)中內(nèi)毒素含量合格，且無溶血反應(yīng)和細(xì)胞毒性反應(yīng)，體現(xiàn)出良好的生物學(xué)特性。因此，研究溫敏型細(xì)胞培養(yǎng)皿的特性能夠?yàn)橘N壁型易損傷細(xì)胞在體外擴(kuò)增和細(xì)胞治療等醫(yī)療應(yīng)用方面提供安全依據(jù)。

[1]GB/T 14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法

[2]Pegtel D M and Gould S J. Exosomes [J].Annu Rev Biochem， 2019， 88： 487-514.

[3]Dey S， Kellam B，Alexander MR， et al. Enzyme-Passage Free Culture of Mouse Embryonic Stem Cells on Thermo-Responsive Polymer Surfaces[J]. Journal of Materials Chemistry， 2011， 21（19）： 6883.

[4]Yang H S， Jeon O， Bhang S H， et al. Suspension Culture of Mammalian Cells Using Thermosensitive Microcarrier That Allows Cell Detachment without Proteolytic Enzyme Treatment[J]. Cell Transplant， 2010， 19（9）： 1123-1132.

[5]Nakajima K，Honda S， Nakamura Y， et al. Intact Microglia Are Cultured and Non-Invasively Harvested without Pathological Activation Using a Novel Cultured Cell Recovery Method[J]. Biomaterials， 2001， 22（11）： 1213-1223.

[6]Plate N A， Lebedeva T L， Valuev L I. Lower Critical Solution Temperature in Aqueous Solutions of Yv-Alkyl-Substituted Polyacrylamides[J]. Polymer Journal， 1999， 31（1）： 21-27.

[7]宋克東，楊延飛，武爽，李麗穎，閆新宇，劉天慶. BMMSCs在溫敏性玻璃微載體上的培養(yǎng)及收獲[J]. 高校化學(xué)工程學(xué)報，2016，30（03）：633-640.

[8]文天用，李放，葉超群，劉連江. 脂肪干細(xì)胞與溫敏型支架構(gòu)建人工髓核的體外研究[J]. 中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2010，16（04）：335-338.

作者簡介：王霄彤，1994年6月，女，江蘇蘇州，助理工程師，中檢華通威國際檢驗(yàn)（蘇州）有限公司，醫(yī)療器械生物相容性檢測