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      樟芝深層發(fā)酵菌絲體提取物對(duì)食源性致病菌的抑制作用

      2022-04-12 03:29:02李華祥蔣文浩王娟娟陸春雷高亞軍賈祿強(qiáng)楊振泉
      中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2022年3期
      關(guān)鍵詞:樟芝菌絲體食源性

      李華祥,石 蠫,蔣文浩,王娟娟,陸春雷,高亞軍,賈祿強(qiáng),楊振泉*

      (1 揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇揚(yáng)州 225127 2 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無(wú)錫 214122)

      樟芝(Antrodia camphorate 或Taiwanofungus camphoratus),又名牛樟芝、牛樟菇等,是一種大型珍稀藥食兩用真菌,屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌目、薄孔菌屬,素有“藥芝之王”、“森林紅寶石”之美譽(yù)[1-2]。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)樟芝在保肝、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗氧化、降血壓、降血脂、緩解疲勞及調(diào)節(jié)免疫等方面具有顯著功效[3-5]。隨后,研究者們從樟芝子實(shí)體及發(fā)酵菌絲體中分離出百余種活性物質(zhì),主要包括三萜類、多糖類及苯環(huán)類等,具有較大的研究潛力及開(kāi)發(fā)價(jià)值[6]。

      國(guó)外學(xué)者Geethangili 等[7]研究發(fā)現(xiàn),樟芝的氯仿及正己烷提取物均能顯著抑制幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)的生長(zhǎng)。Lien 等[8]發(fā)現(xiàn),樟芝的3種有機(jī)溶劑(乙醇、氯仿及乙酸乙酯)提取物均對(duì)口腔細(xì)菌變異鏈球菌(Streptococcus mutans)和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的生長(zhǎng)具有顯著抑制效果,其MIC 值為4~16 μg/mL。國(guó)內(nèi)學(xué)者楊淑賢等[9]及汪雯翰等[10]發(fā)現(xiàn),樟芝的3 種有機(jī)溶劑(甲醇、氯仿及正丁醇)提取物均對(duì)金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)具有顯著抑制效果。李娟等[11]發(fā)現(xiàn),樟芝乙酸乙酯提取物對(duì)7 種多重耐藥性人體致病細(xì)菌的生長(zhǎng)具有顯著抑制效果。

      有關(guān)樟芝菌絲體提取物在抑制食源性致病菌方面的研究較少,尤其是對(duì)副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)及霍亂弧菌(Vibrio cholerae)等弧菌和阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的生長(zhǎng)抑制效果研究尚顯不足。本文以成本低廉且較易獲得的樟芝深層發(fā)酵菌絲體[12]為原料,研究樟芝菌絲體不同提取物對(duì)15 種食源性致病菌的抑制作用,進(jìn)一步補(bǔ)充和完善樟芝活性物質(zhì)在抑菌方面的研究,為開(kāi)發(fā)新型安全高效、功能多樣的食品奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      1.1.1 菌株 本文所用樟芝及所有食源性致病菌菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株[13]。

      1.1.2 試劑 本文中培養(yǎng)樟芝斜面所用的PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)食源性致病菌所用的LBS 培養(yǎng)基及LB 培養(yǎng)基,上海生工;用于配制樟芝發(fā)酵培養(yǎng)基的相關(guān)試劑及其它常規(guī)試劑(分析純),國(guó)藥集團(tuán)(中國(guó))。

      1.2 方法

      1.2.1 樟芝菌絲體的收集 根據(jù)樟芝深層發(fā)酵的前期研究成果,采用5 L 發(fā)酵罐按照文獻(xiàn)[14]中的培養(yǎng)基配方(葡萄糖2%,酵母浸出粉0.2%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,pH 4.5)和發(fā)酵條件(接種量為1×106spore/mL,26 ℃,150 r/min,發(fā)酵10 d)進(jìn)行樟芝深層發(fā)酵,結(jié)束后用4 層紗布過(guò)濾并收集樟芝菌絲體。

      1.2.2 樟芝活性物質(zhì)的提取 將樟芝菌絲體與甲醇、乙醇、乙酸乙酯或蒸餾水按料液比為1∶10 的比例混合,超聲處理45 min 后,靜置過(guò)夜。然后離心(8 000 r/min,10 min,4 ℃)收集上清液,即得樟芝菌絲體提取液[15]。

      將樟芝有機(jī)溶劑提取液70 ℃水浴蒸干后,稱重并用DMSO 溶劑復(fù)溶;將樟芝水提取液真空冷凍干燥,稱重后用水復(fù)溶。最終獲得已知濃度的樟芝菌絲體提取液。

      1.2.3 致病菌的培養(yǎng)及稀釋 參照石瑀等[16]的方法,將食源性致病菌分別接種于LBS 培養(yǎng)基(弧菌)及LB 培養(yǎng)基(非弧菌)中,37 ℃培養(yǎng)12 h。再用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋(梯度為10,共稀釋10個(gè)梯度)并吸取100 μL 各稀釋菌液均勻涂布于平板上,培養(yǎng)10~12 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。最后,根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果將每個(gè)測(cè)試菌的培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋到1×105CFU/mL 備用。

      1.2.4 抑菌譜的測(cè)定 測(cè)定樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜時(shí),我們采用的是牛津杯法[17],具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法,每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù)。

      1.2.5 最小抑菌濃度的測(cè)定 測(cè)定樟芝菌絲體提取物對(duì)食源性致病菌的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC) 時(shí)采用二倍稀釋法[18],具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法,設(shè)置生理鹽水空白對(duì)照組及DMSO 溶劑對(duì)照組,每個(gè)組均設(shè)置6 個(gè)生物重復(fù)。我們將溶劑無(wú)抑菌效果(即根據(jù)分光光度計(jì)檢測(cè)及肉眼觀察結(jié)果,判斷抑菌率為0) 且樟芝菌絲體提取物完全抑菌(即根據(jù)分光光度計(jì)檢測(cè)及肉眼觀察結(jié)果,判斷抑菌率為100%)時(shí)所對(duì)應(yīng)的樟芝菌絲體提取物最低添加濃度視為相應(yīng)的最小抑菌濃度。

      1.2.6 抑菌效果驗(yàn)證 測(cè)定樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)各測(cè)試菌的抑菌率時(shí),我們采用的是平板菌落計(jì)數(shù)法[19]。根據(jù)最小抑菌濃度的檢測(cè)結(jié)果,我們選取副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌及最小弧菌3 株菌株作為測(cè)試菌以驗(yàn)證樟芝甲醇提取物的抑菌效果。具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法,此處以檢測(cè)樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果的操作為例進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。即采用20 mL 玻璃試管為容器,LB 培養(yǎng)基的裝液量為5 mL,接入100 μL 濃度為1×105CFU/mL 的金黃色葡萄球菌菌液,再加入400 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的樟芝菌絲體甲醇提取液(此濃度在最小抑菌濃度檢測(cè)試驗(yàn)中抑菌效果理想且對(duì)應(yīng)的溶劑無(wú)抑菌效果),將試管置于37 ℃、120 r/min 搖床中培養(yǎng),并于8,10,12 h 分別取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。以相同體系中添加400 μL 無(wú)菌生理鹽水代替樟芝菌絲體甲醇提取液的試管作為空白對(duì)照組,每組設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù),根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)測(cè)試菌株的抑菌率。檢測(cè)樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)副溶血性弧菌及最小弧菌的抑菌率時(shí),除了將LB 培養(yǎng)基替換成LBS培養(yǎng)基以外,其余操作均與檢測(cè)樟芝菌絲體提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率操作相同。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 樟芝菌絲體提取物的抑菌譜

      按1.2.2 節(jié)中的方法,獲得質(zhì)量濃度分別為49.6,17.6,44.0,82.0 mg/mL 的樟芝菌絲體甲醇提取液(ME)、乙醇提取液(AE)、乙酸乙酯提取液(EE)及水提液(WE)。分別吸取500 μL 上述4 種樟芝菌絲體提取液并將質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋至15 mg/mL 后,按1.2.4 節(jié)中的方法檢測(cè)樟芝菌絲體不同提取物對(duì)15 株食源性致病菌的抑制效果,獲得各樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜,結(jié)果如表1所示。

      由表1可以看出,4 種樟芝菌絲體提取物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及6 株阪崎腸桿菌均無(wú)明顯抑制作用,但對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均呈現(xiàn)顯著抑制作用。此外,樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)5 株弧菌及蠟樣芽孢桿菌均有較好的生長(zhǎng)抑制效果;樟芝菌絲體乙醇提取物對(duì)河流弧菌及創(chuàng)傷弧菌有較好的生長(zhǎng)抑制效果;樟芝菌絲體乙酸乙酯提取物僅對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有較為顯著的抑制效果;樟芝菌絲體水提物對(duì)霍亂弧菌及創(chuàng)傷弧菌有較好的生長(zhǎng)抑制效果。可見(jiàn),樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣,能顯著抑制15 株測(cè)試菌中7 株菌株的生長(zhǎng)。

      表1 樟芝菌絲體不同提取物的抑菌譜Table 1 The antibacterial spectrum of different extracts from mycelia of Antrodia camphorata

      2.2 樟芝菌絲體提取物的最小抑菌濃度

      在檢測(cè)出不同樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜后,我們進(jìn)一步檢測(cè)了4 種樟芝菌絲體提取物對(duì)其所對(duì)應(yīng)測(cè)試菌株的最小抑制濃度,結(jié)果如表2所示。

      由表2可知,DMSO 對(duì)食源性致病菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用,但抑制效果隨濃度的降低而減弱,直至幾乎無(wú)抑菌效果。將用DMSO 溶解的樟芝菌絲體提取物的抑菌效果與相同濃度的DMSO(表中同一列數(shù)據(jù))抑菌效果相比較后得出,4 種樟芝菌絲體提取物均對(duì)7 株測(cè)試菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用,且最小抑菌質(zhì)量濃度在0.3~41.0 mg/mL 之間。其中,樟芝菌絲體乙醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度最低,為0.3 mg/mL;樟芝菌絲體水提物對(duì)弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度最高,為41.0 mg/mL。

      表2 不同樟芝菌絲體提取物對(duì)測(cè)試菌的抑制作用Table 2 The antibacterial activity of extracts from mycelia of Antrodia camphorata on test bacteria

      (續(xù)表2)

      2.3 樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌效果驗(yàn)證

      由于樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣,抑菌效果最好。因此選擇樟芝菌絲體甲醇提取物及3 株致病菌(金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌) 作為樟芝代表提取物及測(cè)試菌代表菌株,用20 mL 試管體系培養(yǎng),并用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)一步驗(yàn)證樟芝菌絲體提取物對(duì)測(cè)試菌的抑制效果。

      2.3.1 測(cè)試菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 首先測(cè)定了金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及最小弧菌21613的生長(zhǎng)曲線,以確定最佳取樣時(shí)間,結(jié)果如圖1所示。

      由圖1可知,副溶血性弧菌和最小弧菌的遲滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期分別為0~4 h,4~10 h 和10~12 h;金黃色葡萄球菌的遲滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期分別為0~6 h,6~10 h 和10~12 h??梢?jiàn),當(dāng)培養(yǎng)8 h 和10 h 時(shí),3 種菌均處于對(duì)數(shù)期中期及對(duì)數(shù)期末期;培養(yǎng)12 h 時(shí),3 種菌均處于穩(wěn)定期。因此,后續(xù)檢測(cè)樟芝甲醇提取物的抑菌率時(shí),我們分別取培養(yǎng)8,10 h 及12 h 的菌液進(jìn)行涂布及菌落計(jì)數(shù)。

      圖1 測(cè)試菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of test bacterias

      2.3.2 樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌效果 采用平板菌落計(jì)數(shù)法,檢測(cè)樟芝甲醇提取物在最小抑菌濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌不同培養(yǎng)時(shí)間的抑菌率,以進(jìn)一步驗(yàn)證其抑菌效果,結(jié)果如表3所示。

      表3 樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)測(cè)試菌的抑菌率Table 3 The antibacterial rate of methanol extracts from mycelia of Antrodia camphorate on test bacterias

      由表3可知,樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)兩株弧菌的抑菌率在對(duì)數(shù)期中期達(dá)到最大值;而樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果隨培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的增加而增強(qiáng),在穩(wěn)定期時(shí)抑菌率達(dá)到最大值。上述結(jié)果表明,樟芝菌絲體甲醇提取物確實(shí)能顯著抑制金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及最小弧菌的生長(zhǎng),且最大抑菌率均在92%以上,抑菌效果較為理想,從而進(jìn)一步證實(shí)了抑菌譜試驗(yàn)及最小抑菌濃度試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

      3 結(jié)論

      樟芝菌絲體提取物對(duì)15 株食源性致病菌中的7 株(霍亂弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、最小弧菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽孢桿菌)具有較好的抑制效果,且不同提取物對(duì)測(cè)試菌的最小抑菌質(zhì)量濃度范圍在0.3~41.0 mg/mL 之間。其中,樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣,抑菌效果最顯著;平板菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明,樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌的最大抑菌率均在92%以上,抑菌效果極其顯著,進(jìn)一步證實(shí)了樟芝菌絲體提取物的抑菌效果。本研究結(jié)果較具開(kāi)發(fā)價(jià)值及應(yīng)用前景。

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