王靈昭，潘守昊，劉文慧，魏家樂(lè)，程遠(yuǎn)霞，邱春江，王淑軍，顏冬梅

(1.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005；3.連云港百鮮屋食品有限公司，江蘇 連云港 222199)

櫛江珧?yàn)殡p殼綱江珧科軟體動(dòng)物，其后閉殼肌大，呈馬蹄形，占軟體的1/3～1/2，位于貝殼中央。櫛江珧的后閉殼肌鮮美可口，素有“海鮮極品”的美譽(yù)，其干品俗稱 “江珧柱”。目前，櫛江珧的后閉殼肌通常被凍藏和干制。Chen等[1]研究了水溶性殼聚糖復(fù)合谷胱甘肽對(duì)櫛江珧閉殼肌凍藏品質(zhì)的影響。Mohibbullah等[2]研究了過(guò)熱蒸汽復(fù)合熱煙處理對(duì)提高櫛江珧閉殼肌物化品質(zhì)的影響?？偟膩?lái)講，櫛江珧精深加工研究不多，尚需拓展。鮮味在東方國(guó)家深受喜愛(ài)，已被廣泛接受為區(qū)別于酸、甜、苦、咸4種基本滋味的第5種基本滋味[3]。過(guò)量攝入谷氨酸鈉對(duì)人體有害(如引發(fā)高血壓)已被公眾認(rèn)知，核酸類(lèi)鮮味劑(鳥(niǎo)苷酸二鈉、肌苷酸二鈉)易受生鮮食品中磷酸酯酶的生物降解而失去鮮味，因此開(kāi)發(fā)高品質(zhì)新型鮮味劑的市場(chǎng)需求巨大。櫛江珧的后閉殼肌易得且味道鮮美，本文旨在探索櫛江珧后閉殼肌源鮮味物的制備及化學(xué)，以期促進(jìn)鮮味劑發(fā)展，并為櫛江珧的精深加工提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活櫛江珧：連云港百鮮屋食品有限公司提供；琥珀酸鈉：陽(yáng)江市港陽(yáng)香化企業(yè)有限公司；肌苷酸二鈉、鳥(niǎo)苷酸二鈉：河南雙騰實(shí)業(yè)有限公司；味精：上海冠生園天廚調(diào)味品有限公司。

2W阿貝折射儀 上海光學(xué)儀器五廠有限公司；Lambda 35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó) PerkinElmer公司；A300全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國(guó)曼默博爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 櫛江珧閉殼肌源鮮味物的制備研究

將新鮮櫛江珧去殼，取后閉殼肌，清洗后置于≤-18 ℃下冷凍備用。將解凍后的閉殼肌用斬拌機(jī)制成糜狀，然后加水，調(diào)節(jié)pH，攪拌浸提20 min后進(jìn)行熱處理，再經(jīng)5000 r/min離心得到液相溶出物，即為櫛江珧閉殼肌源鮮味物。

依次研究不同料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，糜狀物料/水(g/g)；自然pH值，121 ℃加熱20 min)、不同pH值(6.0，6.5，7.0，7.5，8.0；料液比1∶3，121 ℃加熱20 min)、不同熱處理方式(A為20 ℃預(yù)熱15 min，121 ℃加熱20 min；B為40 ℃預(yù)熱15 min，121 ℃加熱20 min；C為60 ℃預(yù)熱15 min，121 ℃加熱20 min；D為121 ℃加熱20 min；E為煮沸20 min。其他條件：料液比1∶3，pH 7.5)對(duì)溶出物鮮味的影響。溶出物鮮味評(píng)價(jià)采用表1的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)小組由3男、4女組成，對(duì)同組樣品進(jìn)行相對(duì)比較、同時(shí)評(píng)價(jià)。采用Zhuang等[4]的方法，利用不同滋味標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)7名評(píng)價(jià)員進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The standard for sensory evaluation

1.2.2 櫛江珧閉殼肌源鮮味物的指標(biāo)分析

分析最適宜料液比、pH值、熱處理?xiàng)l件下所制備的櫛江珧閉殼肌源鮮味物得率，得率定義為江珧柱溶出物質(zhì)量與離心前物料質(zhì)量的百分比。分析最適宜料液比、pH值、熱處理?xiàng)l件下所制備鮮味物的總固形物含量、可溶性固形物含量、紫外光譜、粗蛋白含量和氨基酸組成?？偣绦挝锖亢涂扇苄怨绦挝锖繙y(cè)定分別執(zhí)行GB 5009.3-2016中的干燥法、NY/T 2637-2014中的折射儀法。將樣品稀釋后，用紫外可見(jiàn)分光光度儀進(jìn)行200～400 nm的掃描。粗蛋白含量測(cè)定執(zhí)行GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法。利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定樣品的氨基酸組成，執(zhí)行GB 5009.124-2016的方法。

1.2.3 其他鮮味劑對(duì)櫛江珧閉殼肌源鮮味物的影響

以最適宜條件下制備的櫛江珧閉殼肌源鮮味物為對(duì)照，參考其他鮮味劑的閾值及用量要求，分別加入不同量的琥珀酸鈉(0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%)、鳥(niǎo)苷酸二鈉(0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)、肌苷酸二鈉(0.10%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.20%)、味精(0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%)，通過(guò)感官評(píng)價(jià)評(píng)估其他鮮味劑對(duì)櫛江珧閉殼肌源鮮味物的影響。采用表2的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)衡量樣品的總體可接受性，若“不可接受”則不予評(píng)分。

表2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The standard for sensory evaluation

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 櫛江珧閉殼肌源鮮味物的制備研究

由圖1中a可知，料液比1∶3的感官得分均顯著地高于料液比1∶1、1∶4和1∶5(P<0.05)，而與料液比1∶2的感官得分相比沒(méi)有顯著性提高(P>0.05)。與料液比1∶2的感官得分比較，雖然料液比1∶3的感官得分沒(méi)有顯著性提高(P>0.05)，但是料液比1∶3可以得到更多量的溶出物，因此料液比1∶3最適宜。圖1中a的結(jié)果表明，基于糜狀物料的特定狀態(tài)和性質(zhì)，加水量過(guò)少或過(guò)多均不合適。加水量過(guò)少，溶出物不僅量少，而且感官品質(zhì)不高；加水量過(guò)多，溶出物的量雖然有所提高，但感官品質(zhì)明顯降低。

圖1 不同因素對(duì)溶出物鮮味的影響Fig.1 Effects of different factors on the umami of soluble substances

由圖1中b可知，pH 7.5的感官得分均顯著地高于其他pH值的感官得分(P<0.05)，因此pH 7.5最適宜。櫛江珧閉殼肌含有水分82.6%、蛋白質(zhì)15.7%[5]，蛋白質(zhì)占非水成分質(zhì)量的85%，因此其非水成分主要是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)、肽或氨基酸越偏離等電點(diǎn)，溶解性越高。蛋白質(zhì)通常具有堿溶酸沉的性質(zhì)，近年來(lái)，堿溶酸沉法常被用于魚(yú)蛋白、蝦蛋白的提取[6-8]。因此，推測(cè)弱堿性pH 7.5導(dǎo)致物料中可溶性蛋白質(zhì)、鮮味肽或其他鮮味物質(zhì)容易溶出，能夠賦予溶出物更高的感官得分。鮮味劑的pH值一般為中性偏酸，而與I+G復(fù)配的鮮味劑的pH值偏堿性；味精、強(qiáng)鮮味精、酵母粉、大豆肽粉以及大豆水解蛋白在pH 6.5～7時(shí)鮮味最強(qiáng)，而干貝素則在 pH 7.5 時(shí)鮮味達(dá)到最強(qiáng)。由此可見(jiàn)，pH值的堿性過(guò)強(qiáng),不利于鮮味劑的呈味。因此，pH 8.0時(shí)的感官得分反而顯著低于pH 7.5的感官得分，這和劉賀等[9]、馮珍泉等[10]的報(bào)道類(lèi)似。

由圖1中c可知，熱處理方式B的感官得分均顯著地高于其他熱處理方式的感官得分(P<0.05)，因此熱處理方式B(40 ℃預(yù)熱15 min，121 ℃加熱20 min)最適宜。大多數(shù)蛋白質(zhì)在45～50 ℃已可察覺(jué)到變性，蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致溶解度顯著下降[11]。圖1中c的結(jié)果表明，對(duì)物料升溫至適宜溫度(40 ℃)進(jìn)行預(yù)熱浸提，該溫度不能過(guò)高，最好不要使蛋白質(zhì)變性而導(dǎo)致溶解度下降，這樣有助于鮮味物的溶出。鮮味肽具有良好的加工特性及熱穩(wěn)定性，Wang等[12]的研究表明牛肉風(fēng)味肽在121 ℃、20 min蒸汽滅菌下的回收率為 97.2%。呈味核苷酸對(duì)溫度和pH都相當(dāng)穩(wěn)定，但在高溫和酸性條件下會(huì)分解，與中性或偏堿性條件相比較，核苷酸在酸性條件下更容易分解[13-14]。此外，高溫加熱具有對(duì)物料的殺菌作用，有利于物料長(zhǎng)期貯存。因此，在櫛江珧閉殼肌源鮮味物的制備時(shí)，本文采用pH 7.5的堿性條件進(jìn)行浸提，40 ℃預(yù)熱15 min后再對(duì)物料進(jìn)行20 min的121 ℃加熱。

2.2 櫛江珧閉殼肌源鮮味物的指標(biāo)分析

由表3可知，櫛江珧閉殼肌源鮮味物的得率為65.8%，但其水分含量高(96.2%)，總固形物含量低(3.78%)，這說(shuō)明物料離心處理后的沉淀物約為34.2%，而其水分含量相對(duì)較低。櫛江珧閉殼肌中蛋白質(zhì)占非水成分質(zhì)量的85%，因此該沉淀物中主體成分為蛋白質(zhì)，其高值化利用值得進(jìn)一步研究。此外，由于樣品的水分含量較高，其濃縮物的鮮味也值得進(jìn)一步研究。樣品的總固形物含量比可溶性固形物含量高0.87%，說(shuō)明樣品中含有少量的不可溶大分子物質(zhì)。樣品的總固形物含量、可溶性固形物含量分別比粗蛋白含量高2.25%和1.38%，說(shuō)明樣品中含有較多的不含氮成分。顯然，樣品中的含氮和不含氮成分共同賦予樣品鮮味。

表3 櫛江珧閉殼肌源鮮味物的基本指標(biāo)Table 3 The basic indexes of umami substances from the adductor muscle of Atrina pectinate %

由圖2 可知，樣品在244 nm處的吸光度逐漸提高，在260～280 nm有明顯吸收峰。鳥(niǎo)苷酸二鈉和呈味核苷酸鈉分別在波長(zhǎng)260，250 nm處有最大吸收[15]。蛋白質(zhì)分子中色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe等側(cè)鏈及肽鍵本身在260～300 nm處都具有紫外吸收的性質(zhì)，Trp和Tyr在280 nm處有一個(gè)吸收峰，Phe在257 nm附近有一個(gè)吸收峰，但是大多數(shù)蛋白都在280 nm附近有一個(gè)吸收峰[16]。因此，樣品在244 nm處的吸光度逐漸提高的原因可能在于樣品中含有呈味核苷酸類(lèi)鮮味物；樣品在260～280 nm有明顯吸收峰說(shuō)明其含有蛋白質(zhì)、肽或氨基酸。表3的結(jié)果說(shuō)明樣品中含有粗蛋白，這在圖2的結(jié)果中得到證明。

圖2 櫛江珧閉殼肌源鮮味物的紫外光譜Fig.2 Ultraviolet spectra of umami substances from the adductor muscle of Atrina pectinate

由表4可知，樣品含有WHO/FAO/UNU對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸模式[17]要求的全部必需氨基酸，必需氨基酸總量滿足WHO/FAO/UNU對(duì)成人(嬰幼兒)所要求的氨基酸模式，但是Leu、Phe+Tyr、Thr、Trp和Val均不能滿足WHO/FAO/UNU對(duì)成人(嬰幼兒)所要求的氨基酸模式，都是限制性氨基酸，這說(shuō)明樣品中氨基酸含量不均衡。樣品含有的Cys、Glu和Asp含量依次為前三名，分別為1.93，2.01，1.13 g/kg。根據(jù)氨基酸的味道特征，氨基酸被歸類(lèi)為鮮味氨基酸(Glu、Asp)、甜味氨基酸(Ala、Gly、Ser、Thr、Pro、Lys)、苦味氨基酸(Arg、His、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val)和無(wú)味氨基酸(Cys)[18]。樣品含有鮮味氨基酸總量為3.14 g/kg、甜味氨基酸總量4.21 g/kg，而苦味氨基酸總量相對(duì)較小(2.23 g/kg)。目前，鮮味肽的構(gòu)效關(guān)系與呈鮮機(jī)制尚不明確[19]，但一些研究[20-23]表明鮮味肽通常含有Glu或Asp，因此Glu和Asp對(duì)樣品的鮮味貢獻(xiàn)以及能否從樣品中分離出鮮味肽值得進(jìn)一步研究。樣品的氨基酸總量為11.51 g/kg，顯然低于粗蛋白含量1.53%，這說(shuō)明樣品中的氮含有非蛋白氮，呈味核苷酸類(lèi)鮮味劑(鳥(niǎo)苷酸二鈉、肌苷酸二鈉)中的氮為非蛋白氮，推測(cè)樣品中可能含有呈味核苷酸類(lèi)成分。此外，樣品含有?；撬?.39 g/kg，牛磺酸對(duì)人體具有許多生理功能，如穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)滲透壓、保護(hù)細(xì)胞、抗氧化、消炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和離子通道等[24]。

表4 櫛江珧閉殼肌源鮮味物的氨基酸組成Table 4 The amino acid composition of umami substances from the adductor muscle of Atrina pectinate

續(xù) 表

2.3 其他鮮味劑對(duì)櫛江珧閉殼肌源鮮味物的影響

由表5可知，和對(duì)照相比，樣品中加入其他鮮味劑(琥珀酸鈉、鳥(niǎo)苷酸二鈉、肌苷酸二鈉和味精)均能顯著提高感官得分(P<0.05)，但應(yīng)控制其他鮮味劑的添加量，過(guò)量添加反而會(huì)使樣品的感官品質(zhì)不可接受。琥珀酸鈉、鳥(niǎo)苷酸二鈉、肌苷酸二鈉和味精的添加量分別不易超過(guò)0.40%、0.06%、0.18%和0.05%。綜合感官得分和成本，樣品添加0.04%～0.05%的味精最合適，其次為添加0.02%～0.03%的鳥(niǎo)苷酸二鈉。味精的閾值為0.03%[25]，0.04%～0.05%的添加量略高于其閾值。鳥(niǎo)苷酸二鈉的呈味閾值約為0.0125%[26]，0.02%～0.04%的添加量也略高于其閾值。協(xié)同增效作用是鮮味物最獨(dú)特的風(fēng)味化學(xué)，也是鮮味劑研發(fā)的重要理論之一。表5的結(jié)果表明，琥珀酸鈉、鳥(niǎo)苷酸二鈉、肌苷酸二鈉和味精對(duì)櫛江珧閉殼肌源鮮味物均具有增效作用。

表5 其他鮮味劑對(duì)櫛江珧閉殼肌源鮮味物的影響Table 5 Effects of other umami agents on the umami substances from the adductor muscle of Atrina pectinate

3 結(jié)論

制備櫛江珧閉殼肌源鮮味物的適宜條件為料液比1∶3、pH 7.5、梯度熱處理方式(40 ℃預(yù)熱15 min，121 ℃加熱20 min)。產(chǎn)物水分含量96.2%、總固形物含量3.78%、可溶性固形物含量2.91%、粗蛋白含量1.53%，含氮和不含氮成分共同賦予產(chǎn)物鮮味。鮮味物氨基酸組成不均衡，鮮味氨基酸和甜味氨基酸的總量較大，鮮味氨基酸總量為3.14 g/kg，甜味氨基酸總量為4.21 g/kg，且該鮮味物含有?；撬帷ｇ晁徕c、鳥(niǎo)苷酸二鈉、肌苷酸二鈉和味精對(duì)該鮮味物均具有增效作用。綜合感官得分和成本，在該鮮味物中添加0.04%～0.05%的味精最合適，其次為添加0.02%～0.03%的鳥(niǎo)苷酸二鈉。該研究結(jié)果能夠?yàn)槔脵苯蚝箝]殼肌開(kāi)發(fā)鮮味劑提供指導(dǎo)。