大連化物所發(fā)展出時空超分辨四維熒光成像 解析全細胞溶酶體

2022年3月16日，中國科學院大連化學物理研究所分子探針與熒光成像研究組研究院徐兆超團隊發(fā)展出在酸性條件下可自閃爍的單分子定位超分辨成像熒光探針LysoSR-549，實現(xiàn)了在12 nm/20 ms時空分辨率下長達40 min的全細胞溶酶體解析。

長時間超分辨熒光成像對于揭示納米尺度的細胞器動力學和功能越來越重要，但由于缺乏高度光穩(wěn)定和環(huán)境敏感的熒光探針為研究工具，一直以來，科研人員對細胞器互作網(wǎng)絡的功能和調(diào)節(jié)機制，尤其是細胞器納米級全景分布和時空過程所知尚少。

溶酶體是多功能細胞器，在降解生物分子、介導細胞代謝和細胞信號傳導中發(fā)揮作用。溶酶體功能障礙在溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病和癌癥中的作用也已得到證實，使溶酶體成為疾病治療靶點之一。溶酶體多重功能是通過溶酶體與其他細胞器的融合或接觸來實現(xiàn)，并由溶酶體動力學介導，包括溶酶體的運動、溶酶體數(shù)量、大小、形態(tài)和腔內(nèi)酸性變化等。越來越多的證據(jù)表明，每個具有不同位置、運動軌跡和化學成分的溶酶體均具有特定的功能;而溶酶體同時受到系統(tǒng)水平上的調(diào)節(jié)，以溶酶體簇等集體行為在整個細胞內(nèi)發(fā)揮功能。破譯全細胞溶酶體的空間分布、化學成分和動力學，可以了解和發(fā)現(xiàn)溶酶體的多功能和作用網(wǎng)絡，解析溶酶體個體功能與系統(tǒng)調(diào)控之間的關系。然而，溶酶體腔內(nèi)是pH值為4.5至5的酸性環(huán)境，使熒光探針無法在此條件下實現(xiàn)長時間的時空超分辨和對溶酶體酸性的動態(tài)識別。

科研團隊將鄰甲基吡啶引入到羅丹明螺酰胺中，開發(fā)了自閃爍探針LysoSR-549。研究發(fā)現(xiàn)，吡啶與異吲哚啉酮處于平面結(jié)構，且吡啶N與羰基處于反式構型。由于吡啶的堿性大于羰基，因而在弱酸性下，質(zhì)子優(yōu)先與吡啶N結(jié)合而遠離羰基;隨著酸度的增加，吡啶環(huán)旋轉(zhuǎn)，質(zhì)子同時與羰基結(jié)合，使pH值在4.5至5范圍內(nèi)的少量染料發(fā)生開環(huán)反應，形成熒光兩性離子;后又與呫噸環(huán)10號位-C發(fā)生親核加成反應，迅速恢復為不發(fā)熒光的螺內(nèi)酰胺，從而完成一次閃爍過程。

基于上述反應機理，LysoSR-549自閃爍參數(shù)pKcycl被降低到3.2，使其能夠在溶酶體pH下進行單分子定位超分辨成像（SMLM），并達到12 nm/20 ms時空分辨率，這是目前所報道的溶酶體超分辨成像中最高的定位精度。同時，溶酶體內(nèi)負載了大量的探針，由于只有少數(shù)探針處于閃爍發(fā)光狀態(tài)，這賦予了探針緩沖能力來抵抗光漂白，使LysoSR-549呈現(xiàn)出較好的光穩(wěn)定性，實現(xiàn)了40 min的長時間超分辨率成像，從而在單個溶酶體分辨的水平上解析了全細胞內(nèi)所有溶酶體的運動軌跡，包括觀察到最長運動距離可達50 μm，最快運動速度可達0.31 μm/s。該探針的單分子光子數(shù)與pH值呈線性關系，從而可以在單分子成像過程中識別每個溶酶體pH值，最終實現(xiàn)了單個溶酶體解析水平上，同時分辨整個細胞中所有溶酶體的動態(tài)和腔內(nèi)pH，并根據(jù)溶酶體分布、大小和腔內(nèi)pH值來分辨出全細胞溶酶體亞群。

LysoSR-549所具備的解析全細胞溶酶體的能力，使立體可視化追蹤和分辨溶酶體成為可能，從而可以發(fā)現(xiàn)很多之前未知的溶酶體化學和生物學信息、破解溶酶體的生物化學。該研究實現(xiàn)了對整個細胞的所有溶酶體跨時間尺度追蹤，也可以聚焦在某一局部，或某一個溶酶體來做研究。

此外，該團隊還對不同外界刺激下的全細胞溶酶體進行分析，發(fā)現(xiàn)不同條件下溶酶體的大小、數(shù)量、分布、動力學和腔內(nèi)pH值均有顯著差異，這或為溶酶體相關疾病診斷提供新方法。

相關研究成果以An Acid-regulated Self-blinking Fluorescent Probe for Resolving Whole-cell Lysosomes with Long-term Nanoscopy為題，發(fā)表在《德國應用化學》上。研究工作得到國家自然科學基金、大連化物所創(chuàng)新基金等的支持。

（來源：中國科學院大連化學物理研究所）