張莉紅，陳新娟，李 杰*,3，王亞娥，楊 超，張可軒，張雨薇，曾可欣

(1. 蘭州交通大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅省膜科學(xué)技術(shù)研究院有限公司，蘭州 730020；3. 甘肅省非常規(guī)水資源化利用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730020)

在現(xiàn)有供水系統(tǒng)無(wú)法滿足需求的一些西北黃土干旱半干旱地區(qū)，廣泛開(kāi)展的雨水收集不僅有效地緩解了水資源短缺，最大限度地減少了水土流失和洪澇災(zāi)害，而且為農(nóng)業(yè)發(fā)展提供了可能性[1-3].通過(guò)使用不同的集雨面，如砂漿屋頂和水泥鋪成的庭院，夯實(shí)的土地或道路表面，可有效地收集雨水并儲(chǔ)存在不同材質(zhì)水窖中[2-5].

窖水水質(zhì)因子眾多，且受氣候[1]、周圍環(huán)境[2]的影響.大量研究表明[2-4]，雨水在集流過(guò)程中受到大氣、集流面以及入窖過(guò)程中窖壁或底泥的污染，長(zhǎng)期飲用會(huì)引發(fā)腸道疾病.西北山谷眾多，大氣污染物的擴(kuò)散特性有限，不會(huì)造成致病性的污染[5].趙文君等[6]對(duì)水泥、固化土和橡塑水窖中濁度、pH值、COD等水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)不同材質(zhì)的水窖對(duì)雨水水質(zhì)的影響各有優(yōu)劣，如水泥砂漿水窖濁度較優(yōu)但pH值偏高，而橡塑水窖pH值較優(yōu)但COD值偏高，固化土水窖除濁度高外其余指標(biāo)均較好.Amin等發(fā)現(xiàn)從屋頂收集的雨水比從露臺(tái)集水區(qū)收集的雨水的細(xì)菌學(xué)質(zhì)量更高.與庭院收集的雨水相比，公路收集的雨水質(zhì)量較差[7].這些結(jié)果表明，集雨面的不同對(duì)窖水質(zhì)量有較大的影響，各水質(zhì)參數(shù)在時(shí)間上存在顯著差異，例如細(xì)菌學(xué)參數(shù)一般會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而得到改善.對(duì)不同時(shí)期窖水水質(zhì)的研究大多集中在對(duì)豐水期和枯水期的水質(zhì)差異性的研究.窖水質(zhì)量在夏季之后趨于改善，冬季窖水質(zhì)量最高，這種趨勢(shì)在總大腸菌群中最為明顯[8].但不同集雨面不同時(shí)間窖水水質(zhì)的污染特征研究較少，尤其是人為活動(dòng)較頻繁的地方和牲畜養(yǎng)殖場(chǎng)所等.已有研究表明[8]，儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)窖水水質(zhì)的改善起著至關(guān)重要的作用.儲(chǔ)存過(guò)程中窖水由于自凈作用(特別是生物降解作用)使水中各污染物都有不同程度的降解[9-10].目前對(duì)于不同集雨面窖水的生物降解作用也尚不明確.

本文研究了三種不同集雨面水窖中一年的窖水常規(guī)參數(shù)及細(xì)菌學(xué)參數(shù)變化，著重探討了不同集雨面在不同時(shí)間對(duì)窖水水質(zhì)的影響.并且采用廣泛應(yīng)用于地表水和城市飲用水水質(zhì)評(píng)價(jià)的綜合指數(shù)評(píng)價(jià)法[11-12]進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià).通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同集雨面窖水的生物降解作用.本研究結(jié)果將為西北黃土及其他干旱半干旱地區(qū)集雨工程在集雨面形式以及改善窖水衛(wèi)生質(zhì)量方面提供了進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從2018年12月到2019年11月連續(xù)一年采集水樣，對(duì)象為甘肅省定西市某農(nóng)村農(nóng)戶不同集雨面的三口水泥材質(zhì)水窖.具體特征參見(jiàn)表1.微生物樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)取樣，取700 mL的水樣經(jīng)0.22 μm聚碳酸酯膜負(fù)壓過(guò)濾，收集濾膜，用事先滅菌且經(jīng)過(guò)75%的酒精消毒的醫(yī)用剪刀剪碎后，置于2 mL的無(wú)菌離心管中，于-80 ℃的超低溫冰箱中保存至DNA提取.

表1 甘肅省定西市某農(nóng)村水窖

1.2 檢測(cè)分析

定期檢測(cè)窖水濁度、pH、CODMn等常規(guī)污染指標(biāo)和細(xì)菌總數(shù)、總大腸菌群等細(xì)菌學(xué)指標(biāo)，各類指標(biāo)檢測(cè)均出自國(guó)家城市供水水質(zhì)監(jiān)測(cè)網(wǎng)蘭州監(jiān)測(cè)站.根據(jù)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 5750-2006)考察了一年內(nèi)窖水的水質(zhì)情況.

1.3 水質(zhì)評(píng)價(jià)

1.3.1 水質(zhì)分指數(shù)

根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的水質(zhì)指數(shù)，公式為Ii=Ci/Si，其中：Ci為指標(biāo)檢測(cè)濃度實(shí)測(cè)值的平均值；Si為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值[11-12].

1.3.2 水質(zhì)類指數(shù)

1.3.3 水質(zhì)綜合指數(shù)

表2 水質(zhì)綜合評(píng)價(jià)各類指標(biāo)權(quán)重

表3 評(píng)價(jià)級(jí)別的劃分及其意義[13]

1.4 高通量測(cè)序分析

首先提取總DNA，同時(shí)采用Nanodrop對(duì)DNA進(jìn)行定量，并通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量.PCR擴(kuò)增采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物為F∶ACTCCTACGGGAGGCAGCA，反向引物為R∶GGACTACHVGGGTWTCTAAT，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照.PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；27個(gè)循環(huán)；72 ℃后保溫5 min，于4 ℃保存.對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量?jī)x器為Microplate reader(BioTek,FLx800).根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量需求，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合.采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù).然后上機(jī)進(jìn)行測(cè)序(上海派森諾生物科技有限公司).

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)參數(shù)分析

常規(guī)水質(zhì)參數(shù)濁度、pH值和CODMn都會(huì)根據(jù)集流過(guò)程中周圍環(huán)境而有顯著差異.集雨面對(duì)這類常規(guī)水質(zhì)參數(shù)有較大影響，尤其是濁度.CODMn對(duì)集雨面的類型也較敏感.如圖1所示，全年3個(gè)水窖中濁度均超過(guò)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 5750-2006).但窖水濁度差異較大，依次為1#>3#>2#，集雨面環(huán)境衛(wèi)生較好的2#水窖濁度較低，且全年變化不大，而集雨面環(huán)境衛(wèi)生較差的1#水窖濁度最高且變化較大，說(shuō)明窖水濁度受集雨面的影響較大，這與已有研究相似[1,9]，人工清掃集雨面污染物去除率可達(dá)70%[14].1#、3#水窖水全年中只有6、7、8月份濁度較高，因?yàn)槲鞅钡貐^(qū)降雨分配不均，6～8月份是雨季，窖水濁度受雨季降雨所影響，武福平等[9]研究了8月份暴雨過(guò)后窖水水質(zhì)，發(fā)現(xiàn)初期雨水濁度較大，隨著沉降作用逐漸降低直至穩(wěn)定.

CODMn也呈現(xiàn)出和濁度一致的趨勢(shì).發(fā)現(xiàn)同一時(shí)間段濁度較高的水窖CODMn也較大.全年整體CODMn依次為1#>3#>2#，1#全年CODMn超過(guò)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 5750-2006).3#有5個(gè)月超標(biāo)，分別是6月、8月至11月.2#只有2個(gè)月超標(biāo)，分別為2月和9月.CODMn一定程度上與周圍環(huán)境息息相關(guān)，說(shuō)明相比2#、3#水窖，1#水窖因人為活動(dòng)頻繁而周圍較不潔凈，入窖過(guò)程中集雨面土面離子的釋放和水流的挾帶作用導(dǎo)致CODMn的增加[15].2#，3#窖CODMn在9月突增，是因?yàn)?#、3#窖水的pH較低所致(見(jiàn)圖1)，張建鋒等[15]研究了西北農(nóng)村水窖集雨場(chǎng)表面土壤離子釋放特征發(fā)現(xiàn)，pH越低，集雨面土壤離子釋放容量越大.

圖1 不同時(shí)間段濁度、CODMn、pH變化Fig.1 Turbidity,CODMn,and pH changes in different time periods

pH值基本在7.7±0.23～8.7±0.51之間，整體呈偏堿性范圍，pH值基本符合《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 5750-2006)，這與已有研究類似[2,16].pH<4和pH>11的飲用水會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生有害影響.張國(guó)珍等[15]研究了黃土塬地區(qū)村鎮(zhèn)集蓄雨水水質(zhì)，發(fā)現(xiàn)pH偏堿性，隨降雨歷時(shí)的變化不是很明顯.需要說(shuō)明的是，1#水窖前5個(gè)月pH較高是因?yàn)樗巡捎盟嘈扪a(bǔ)所致，硅酸鹽水泥材質(zhì)在水化和水解過(guò)程析出了碳酸鈣等堿性物質(zhì)所致[17].此外，pH升高也可能是由于有機(jī)碎屑、粘土和礦物顆粒所致[2].

2.2 細(xì)菌學(xué)參數(shù)分析

目前，窖水質(zhì)量的常見(jiàn)健康問(wèn)題與細(xì)菌有關(guān)，尤其是總大腸桿菌.為了確定窖水中可能存在的致病微生物，最廣泛使用的指標(biāo)也是總大腸菌群.張曉華等[18]調(diào)查了甘肅農(nóng)村7個(gè)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的窖水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌總數(shù)均超標(biāo)嚴(yán)重，大腸菌群只有少數(shù)鄉(xiāng)鎮(zhèn)窖水以個(gè)位數(shù)檢出，不同時(shí)間段大腸桿菌的變化如圖2所示，從圖2可以看出，本研究總大腸菌群在8～10月超標(biāo)嚴(yán)重，受集雨面影響較小.菌落總數(shù)在人為活動(dòng)密集的集雨面有個(gè)別月份含量較高.這一結(jié)果與張曉華等研究結(jié)果不一致.2#，3#菌落總數(shù)數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定；1#窖水菌落總數(shù)整體較高，并且變幅較大.其原因可能是1#位于門(mén)口，集流面由于人為活動(dòng)造成的污染源相對(duì)較多.總大腸桿菌群是反映糞便污染的重要指標(biāo)，3個(gè)水窖的總大腸桿菌群均得檢出，3個(gè)窖水在前7個(gè)月中數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定，可能是由于這幾個(gè)月無(wú)進(jìn)水，儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)細(xì)菌學(xué)參數(shù)的質(zhì)量有所改善，Amin等[2]表明大約1周的存儲(chǔ)時(shí)間后，細(xì)菌學(xué)參數(shù)濃度降低了70%至90%.1#、3#窖水總大腸菌群整體較高，尤其是9月和10月.可能原因是集流場(chǎng)所時(shí)常有家畜出現(xiàn)，廁所和馬廄等大多建在離集流場(chǎng)所和房屋很近的地方，沒(méi)有及時(shí)清理周邊家禽糞便.2#窖8月和10月總大腸菌群主要是由于樹(shù)葉和樹(shù)葉上鳥(niǎo)糞等廣泛分布的結(jié)果.灰塵雜質(zhì)攜帶促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的促進(jìn)劑[19].總之，總大腸桿菌群與菌落總數(shù)與環(huán)境和衛(wèi)生條件有關(guān)，建議定期清理集雨面，尤其是人類活動(dòng)和禽畜活動(dòng)頻繁地帶，以保證窖水質(zhì)量.

圖2 不同時(shí)間段菌落總數(shù)和總大腸菌群變化Fig.2 Changes in the total number of colonies and total coliforms in different time periods

2.3 水質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果

窖水水質(zhì)列于表4.綜合評(píng)價(jià)根據(jù)表4可得：2#水窖I總為第2等級(jí)，水質(zhì)較好，基本滿足生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)；1#和3#水窖I總為第3等級(jí)，也可以滿足灌溉用水和畜牧用水.從水質(zhì)綜合指數(shù)評(píng)價(jià)結(jié)果來(lái)看，水質(zhì)指數(shù)依次為1#>3#>2#，與實(shí)測(cè)結(jié)果相似，說(shuō)明采用該水質(zhì)綜合評(píng)價(jià)方法對(duì)窖水水質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果可靠，能反映窖水水質(zhì)的實(shí)際情況.

表4 窖水水質(zhì)指數(shù)

從類指數(shù)來(lái)看，1#窖水和3#窖水水質(zhì)的感官指標(biāo)分別為重度污染和中度污染，1#窖水、2#窖水和3#窖水細(xì)菌學(xué)指標(biāo)的分指數(shù)均屬于重污染范圍，可以得出：細(xì)菌污染是影響定西市農(nóng)村窖水水質(zhì)衛(wèi)生的根源，細(xì)菌污染狀況不容忽視[2].

進(jìn)一步從作為飲用水的2#窖水細(xì)菌學(xué)指標(biāo)的分指數(shù)看，細(xì)菌總數(shù)的分指數(shù)為3.36，總大腸菌群的分指數(shù)為2，總大腸菌群是評(píng)定水被糞便污染的重要指示菌，顯示窖水中細(xì)菌的污染主要來(lái)源.1#窖水和3#窖水同樣存在此污染情況.

2.4 生物降解作用分析

2.4.1 微生物多樣性分析

三口水窖的多樣性指數(shù)如圖3所示.D4、D5、D6分別代表1#、2#、3#水窖的微生物.Chao1指數(shù)和Observedspecies指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高.Shannon指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度.Simpson指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高.可以看出，1#水窖的豐富度最高，2#水窖次之，3#水窖的豐富度最低.而多樣性高低順序?yàn)?#>3#>1#.從Shannon指數(shù)的變化來(lái)看，與3#水窖相比，1#和2#水窖微生物群落的豐富度和均勻性都較高.同時(shí)可以看出，四種指標(biāo)的p>0.05，說(shuō)明各樣品之間不具有顯著性差異，樣品可能來(lái)源相同，這與三口窖同屬于水泥窖相對(duì)應(yīng).

圖3 微生物群落豐富度和多樣性分析Fig.3 Analysis of the abundance and diversity of microbial communities

2.4.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

三口水窖在門(mén)水平上的微生物群落如圖4所示.可以看出，三口水窖在門(mén)水平上的主要菌門(mén)有8種，分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)，構(gòu)成了門(mén)水平上水泥窖水的基本群落結(jié)構(gòu).其中豐度最大的菌為變形菌門(mén)，豐度分別為65.7%、55.1%、45%.變形菌門(mén)主導(dǎo)了系統(tǒng)的生物凈化過(guò)程[20-21].其次為放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，在1#水窖中豐度分別為22.3%和9.1%，在2#水窖中豐度分別為23.5%和13.2%，在3#水窖中豐度分別為20.9%和30.1%.放線菌門(mén)對(duì)水中有機(jī)碳具有分解作用[22-23]，擬桿菌門(mén)具有有機(jī)物降解的功能[24-25]，可以看出，不同集雨面窖水中微生物群落結(jié)構(gòu)具有明顯的差異.結(jié)合2.1節(jié)，3#水窖中較高的有機(jī)物含量富集了大量擬桿菌門(mén).結(jié)果表明不同集雨面顯著影響了微生物群落結(jié)構(gòu).

圖4 門(mén)水平上微生物群落結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of microbial community structure at the phylum level

為了進(jìn)一步分析窖水中的功能菌的變化情況，本文對(duì)相對(duì)豐度前20的屬水平上的細(xì)菌做了微生物層次聚類分析，如圖5所示.從分類樹(shù)圖可以看出，本次取樣較為合理，同組之間均勻度較高.從柱狀圖可以看出屬水平與污染物降解有關(guān)的菌主要有沼澤菌(Limnohabitans)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、鞘氨醇桿菌(Sphingorhabdus)、魚(yú)孢菌(Sporichthyaceae)、景天胺桿菌(Sediminibacterium)、甲基化菌(Methylotenera)、假單胞菌(Pseudomonas).在1#水窖中豐度分別為19.8%、1.03%、1.01%、1.97%、4.1%、1.87%、1.96%、0.46%，在2#水窖中豐度分別為4.04%、1.95%、0.27%、5.98%、2.25%、4.49%、1.77%、0.20%，在3#水窖中豐度分別為7.5%、11.7%、2.56%、4.03%、3.05%、1.6%、0.26%、1.94%.沼澤菌和魚(yú)孢菌與溶解性有機(jī)物的降解有關(guān)，能夠消耗低分子量碳[26].景天胺桿菌為好氧菌，在硝酸鹽去除[27]、有機(jī)物降解[28]以及氯化物去除[27]方面意義重大.不動(dòng)桿菌不僅有助于難降解污染物的降解[28]，而且在硝酸鹽的去除中也起著重要作用[29].黃桿菌屬于擬桿菌門(mén)，為好氧菌，能夠降解淀粉、纖維素、脂肪等復(fù)雜有機(jī)物，同時(shí)合成新的微生物體[30-31].甲基化菌為窖水中的關(guān)鍵微生物菌屬，參與窖水中污染物的降解[32].鞘氨醇桿菌在多環(huán)芳烴的降解中具有重要作用[33].結(jié)合水質(zhì)分析，進(jìn)一步說(shuō)明了低豐度菌，如鞘氨醇桿菌和景天胺桿菌，也對(duì)微生物群落有著顯著貢獻(xiàn)[32].

圖5 屬水平上微生物群落結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of microbial community structure at the genus level

3 結(jié)論

1) 全年3個(gè)水窖中濁度、總大腸菌群和菌落總數(shù)均超過(guò)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 5750-2006)；濁度普遍超出10倍以上；細(xì)菌總數(shù)和總大腸桿菌群分別超出40倍和30倍以上；CODMn只有1#水窖全年超標(biāo)，而2#、3#水窖只有個(gè)別月份超標(biāo)；pH值基本在7.7±0.23～8.7±0.51之間；窖水水質(zhì)污染因子年內(nèi)變化較大，每年3月或4月污染指數(shù)開(kāi)始增大，到7月或9月達(dá)到最大值之后逐漸降低；窖水水質(zhì)指標(biāo)濁度、pH、CODMn等常規(guī)參數(shù)和總大腸菌群、菌落總數(shù)等細(xì)菌學(xué)參數(shù)均受集雨面影響較大.

2) 水質(zhì)綜合評(píng)價(jià)方法對(duì)該水泥窖水水質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果一致；不同集雨面受污染程度依次為：1#水窖>3#水窖>2#水窖.

3) 水泥窖水中與污染物降解有關(guān)的菌主要有沼澤菌、黃桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、鞘氨醇桿菌、魚(yú)孢菌、景天胺桿菌、甲基化菌、假單胞菌；不同集雨面窖水中菌的豐度不同，鞘氨醇桿菌和景天胺桿菌對(duì)微生物群落有著顯著貢獻(xiàn).