劉映彤，薛林貴*，何園園，寇嘉賓，王 歡，張怡洋，許雅潔

(1. 蘭州交通大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

工業(yè)發(fā)展通常伴隨著頻繁的金屬礦業(yè)的開(kāi)采、冶煉活動(dòng)，導(dǎo)致大量的工業(yè)廢水及廢氣被不當(dāng)排放，部分礦區(qū)周邊的農(nóng)田和土壤重金屬含量因此嚴(yán)重超標(biāo)，土壤植被覆蓋率下降、微生物多樣性降低[1-3].環(huán)境中的重金屬經(jīng)由食物鏈傳播被人體攝取后，會(huì)對(duì)人體健康造成巨大危害[4].迄今為止，針對(duì)重金屬污染土壤修復(fù)的方法主要由生物法、化學(xué)法和物理法構(gòu)成[5].其中生物法因其經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、操作簡(jiǎn)便，對(duì)環(huán)境無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，受到學(xué)界廣泛關(guān)注.在生物法修復(fù)中，微生物-植物聯(lián)合修復(fù)作為最有效的一種原位修復(fù)方式，具有廣闊的應(yīng)用前景[6].

在砷污染尾礦土壤中，砷主要以砷酸鹽和金屬硫化物的形式存在.在自然條件下，As3+和As5+是砷的主要存在形態(tài)，相較于有機(jī)砷，無(wú)機(jī)形式的砷具有更強(qiáng)的毒性和流動(dòng)性[7].抗砷微生物一般由于其對(duì)砷具有一定吸附或轉(zhuǎn)化能力，因而對(duì)砷具有耐受性.目前已發(fā)現(xiàn)多種植物及微生物具有富集或轉(zhuǎn)化砷的能力，但多數(shù)針對(duì)抗砷菌的研究所篩選出的菌株僅對(duì)單一價(jià)態(tài)的砷具有耐性，且耐受性均不是很高[8-11].張鳳鳳等[12]從湖南省婁底市雙峰縣的鉛鋅尾礦區(qū)篩選分離出可耐受500 mg·L-1As3+的砷氧化菌；郭盾等[13]篩選自云南省砷污染土壤的庫(kù)克菌(Kocuriacarniphila)最高可耐受1 000 mg·L-1的As3+.Fan等[14]從山陰縣高砷沉積物中鑒定得到亞砷酸鹽氧化細(xì)菌、砷酸鹽還原細(xì)菌和亞砷酸鹽氧化酶基因，主要為變形菌(Proteobacteria).穆遙等[15]自江漢平原仙桃市沙湖鎮(zhèn)夾湖村的高砷沉積物中分離出抗砷菌，分別可耐受48 mmol·L-1As5+和10 mmol·L-1As3+的菌株，為假氨基桿菌屬(Pseudaminobacter).陳倩等[16]從湖南石門(mén)和郴州的土壤中篩選得到多株可耐受20 mmol·L-1Na2As3O4的砷還原菌，多為放線菌.目前針對(duì)土壤中分離得到的菌株砷耐受濃度均不高，多數(shù)僅進(jìn)行單一價(jià)態(tài)砷的耐受分離.因此在后續(xù)研究中有價(jià)值分離篩選出高耐受多種價(jià)態(tài)砷的抗砷菌株，并發(fā)掘更多不同種屬的抗砷菌株，有助于進(jìn)一步探明各菌屬的抗砷機(jī)制.

甘肅省臨澤縣部分鐵礦，因其長(zhǎng)期從事開(kāi)采活動(dòng)，導(dǎo)致大量尾礦堆積.通過(guò)對(duì)尾礦土壤采樣分析，發(fā)現(xiàn)包括砷、鉛、鎘、錳在內(nèi)的多種重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)，且實(shí)驗(yàn)室已從該土壤中分離鑒定出多株對(duì)重金屬耐受的菌株.此外，由于礦區(qū)土壤貧瘠，且存在多種重金屬污染，不同重金屬在土壤中又有多種賦存形態(tài)，因此對(duì)植物存在毒害作用，從而抑制植物的正常生長(zhǎng).一方面，促生菌株本身所產(chǎn)生的活性物質(zhì)可改善土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)；另一方面，抗砷菌株可通過(guò)轉(zhuǎn)化砷元素形態(tài)，協(xié)同植物富集吸收砷.本研究擬篩選出對(duì)As3+和As5+均有高耐受性，且兼具促生作用的菌株，并對(duì)供試菌株的除砷性能進(jìn)行初步探究，以期為后續(xù)開(kāi)展植物-微生物聯(lián)合修復(fù)砷污染土壤實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)和菌種資源.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中選取10株菌進(jìn)行抗砷菌株篩選，編號(hào)分別為L(zhǎng)SP1(MW485635.1)、LSP2(MW485636.1)、LSP3(MW485637.1)、LSP4(MW485638.1)、LSP11(MW485644.1)、LSM1(MW485107.1)、LSM2(MW485108.1)、LSM3(MW485109.1)、LSM10(MW485112.1)、LSM12(MW485113.1).另從尾礦土壤中篩選出一株高抗砷菌株，編號(hào)為L(zhǎng)YT1.實(shí)驗(yàn)供試菌株分離源土壤均采自甘肅省張掖市臨澤縣境內(nèi)中北部一處鐵尾礦，包括砷、鉛在內(nèi)的多種重金屬含量均超標(biāo).采樣地尾礦面積大約25 000 m2，海拔1 300～1 400 m，土壤原始pH為7.57～8.59.當(dāng)?shù)貫榇箨懟哪菰瓪夂颍昃邓亢驼舭l(fā)量分別為118.4 mm和1 830.4 mm，年平均氣溫為7.7 ℃.

1.1.2 主要儀器試劑及培養(yǎng)基

主要儀器：紫外-可見(jiàn)分光光度儀，4802 US/VIS型(美國(guó)Unico公司)；PCR擴(kuò)增儀和 DNA 電泳儀，JY-600C型(廣州市深華生物技術(shù)有限公司).

砷溶液的配制：亞砷酸鈉(NaAsO2)，稱(chēng)取亞砷酸鈉(分析純)0.7 g，溶于200 mL蒸餾水，得到2 000 mg·L-1的As3+母液；砷酸鈉(Na3AsO4)，稱(chēng)取砷酸鈉(分析純)6.65 g，溶于200 mL蒸餾水，得到12 000 mg·L-1的As5+母液，使用時(shí)過(guò)濾除菌.

CAS染液：0.1 mmol·L-1FeCl3，1 mmol/LCAS(鉻天青)， 0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4·12H2O 2.427 g，KH2PO40.075 g，NaH2PO4·2H2O 0.590 5 g，NaCl 0.125 g，NH4Cl 0.250 g，pH為6.8，使用前10倍稀釋)，4 mmol·L-1HDTMA.

Salkowski比色液:2 mL0.5 mol·L-1FeCl3·6H2O，98 mL30%高氯酸.

本文菌株分離及篩選所用培養(yǎng)基如表1所列.

表1 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基

1.2 研究方法

1.2.1 As耐受菌株的篩選

取5.0 g土樣置于滅菌后的95 mLLB培養(yǎng)基，加入過(guò)濾除菌后的亞砷酸鈉溶液，使As3+濃度為50 mg·L-1.富集培養(yǎng)24 h后，以2%接種量轉(zhuǎn)接至As3+濃度為100 mg·L-1的培養(yǎng)基中，以相同條件培養(yǎng)，并逐步提高As3+濃度，轉(zhuǎn)接5次后進(jìn)行稀釋涂布，分離并保存長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株.同時(shí)將實(shí)驗(yàn)室低溫保藏的菌株分別活化至OD600 nm=0.8～1.0，涂布至LB固體培養(yǎng)基，將分離出的單菌落傳代3次.向50 mLLB培養(yǎng)基中添加過(guò)濾除菌后的亞砷酸鈉溶液，以上述相同條件進(jìn)行培養(yǎng)，并不斷提高As3+濃度，以此篩選獲得As3+高耐受菌株.

對(duì)初篩獲得的As3+高耐受菌株進(jìn)行As5+耐受性分析.將活化后的菌株接種至As5+濃度為50 mg·L-1的50 mLLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件與方法均與初篩時(shí)相同，最終得到對(duì)于As3+與As5+均高耐受的菌株，并確定菌株的最大耐受濃度.

1.2.2 菌株16SrRNA基因鑒定

將篩選出的供試菌株梯度稀釋涂布至平板，觀察菌落及革蘭氏染色后的形態(tài).由細(xì)菌DNA提取試劑盒對(duì)菌株LYT1進(jìn)行DNA提取，并以細(xì)菌通用引物27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR.PCR反應(yīng)體系如表2所列.擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序.在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提交測(cè)序結(jié)果并進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，并通過(guò)MEGA7.0，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.3 菌株促生作用研究

探究供試菌株是否具有促生作用，為后續(xù)重金屬污染土壤的植物生長(zhǎng)及生物修復(fù)提供菌種資源.

1) 解磷能力測(cè)定

配制PKO固體培養(yǎng)基，將活化培養(yǎng)至OD600 nm=0.8～1.0的菌液稀釋涂布至平板培養(yǎng)基，在28 ℃下培養(yǎng)3 d，具有解磷作用的菌株，會(huì)在菌落周?chē)纬赏该鞯娜芰兹?

2) 固氮能力測(cè)定

將活化的菌液梯度稀釋涂布至阿須貝氏固氮培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察平板上有無(wú)菌落形成，將單個(gè)菌落連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，能穩(wěn)定生長(zhǎng)的菌株即為固氮菌.

3) 產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定

將分離純化后的菌株以分區(qū)點(diǎn)接種法接種于CAS檢測(cè)平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落，若菌落周?chē)嬖诿黠@的橙黃色暈圈，則證明菌株具有產(chǎn)鐵載體能力.

4) 產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)能力測(cè)定

將供試菌株接種于50 mL的King’B培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)3 d后，將菌懸液8 000 r·min-1離心6 min，分別取500 μL的上清液和500 μL的Salkowski比色液加入1.5 mL的離心管，于暗處?kù)o置30 min，等待顯色.此外，分別以等量未接菌的空白培養(yǎng)基和50 mg·L-1的IAA替換菌液，作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照.可通過(guò)顏色變化初步判斷菌株是否有產(chǎn)IAA能力，顏色越深則代表菌株產(chǎn)IAA的分泌量越多.

1.2.4 菌株生長(zhǎng)條件研究

1) pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

配制50 mLLB培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為5、6、7、8、9，分別在培養(yǎng)4 h、8 h、12 h、24 h、28 h、32 h、36 h、48 h時(shí)測(cè)定生物量(OD600 nm).

2) 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株接種于50 mLLB培養(yǎng)基，分別在溫度為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，最適pH條件下培養(yǎng)，在上述相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定生物量(OD600 nm).

3) As5+對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在50 mLLB培養(yǎng)基中添加砷酸鈉溶液，使培養(yǎng)基中As5+濃度分別為50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1，在最適pH及溫度條件下培養(yǎng)，在上述相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定生物量(OD600 nm).

觀察各菌株在以上不同條件下的生長(zhǎng)情況，每組處理設(shè)置3個(gè)平行，并用Origin8.0繪制生長(zhǎng)曲線.

1.2.5 復(fù)合菌株對(duì)水體中砷的去除能力研究

在構(gòu)建復(fù)合菌劑前首先對(duì)高耐砷菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn).具體方法參考瓊脂擴(kuò)散法[17].將菌株LSM1和LYT1分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取40 μLLSM1菌懸液加入滅菌后冷卻至50 ℃的200 mL的LB固體培養(yǎng)基中，搖勻后倒平板，待其凝固后，用直徑為3 mm的打孔器打孔，并在孔中加入40 μL的LYT1菌懸液，30 ℃下培養(yǎng)3 d，若打孔洞周?chē)型该鞯囊志π纬?，則兩菌之間存在抑制作用.

將菌株LSM1、LYT1分別在最適生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，各取1 mL菌液加入50 mL滅菌的LB培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r·min-1下培養(yǎng)12 h后獲得復(fù)合菌劑.分別配制As5+濃度為50 mg·L-1和100 mg·L-1的LB培養(yǎng)基，之后分別接種菌株M1、LYT1及復(fù)合菌劑，以相同條件培養(yǎng)，分別在對(duì)數(shù)期(24 h)和穩(wěn)定期(48 h)取樣，將菌液8 000 r·min-1離心6 min.以ICP-MS測(cè)定上清液中As5+的濃度，主要工作條件為：功率1 550 W，輔助氣流及載氣流量1 L/min，樣品提升量1 mL·min-1.分別以不加As5+和不加菌的培養(yǎng)基作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，利用公式(1)計(jì)算水體中的砷去除率.

(1)

式中：n表示As去除率；Co表示培養(yǎng)基中原始砷濃度(mg·L-1)；Ce表示處理后液體中剩余砷濃度(mg·L-1).

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

菌株測(cè)序后的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).所有數(shù)據(jù)儲(chǔ)存至Microsoft Excel 2019，并通過(guò)SPSS 26和Origin 2019繪制圖形.

2 結(jié)果與分析

2.1 高抗砷菌株的篩選

在經(jīng)過(guò)As3+的初篩后，各菌株的生長(zhǎng)狀況如圖1所示.如圖1可知，在As3+濃度達(dá)到300 mg·L-1前，11株菌均可生長(zhǎng).各菌株的生長(zhǎng)隨著As3+濃度不斷升高而逐漸被抑制.其中菌株LSM1、LSM3和LYT1對(duì)As3+表現(xiàn)出較高的耐受性，在As3+濃度為3 000 mg·L-1的培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，兩株菌最大耐受濃度為3 200 mg·L-1.因此表明，以上三種菌株為高耐As3+的優(yōu)勢(shì)菌株.

圖1 菌株在不同As3+濃度下的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of strains under different As3+ concentration

對(duì)初篩得到的LSM1、LSM3、LYT1進(jìn)行As5+耐受復(fù)篩，最終獲得兩株兼具對(duì)As3+和As5+高耐受性的菌株，分別是LSM1和LYT1，兩者對(duì)As5+的最大耐受濃度分別可達(dá)5 500 mg·L-1和6 000 mg·L-1，最終被選擇作為后續(xù)研究的供試菌株.

2.2 菌株的鑒定

菌株LSM1和LYT1的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，如圖2所示.LSM1的菌落較大，呈米白色圓形，為革蘭氏陽(yáng)性菌.LYT1為白色菌落，表面干燥并凸起，邊緣規(guī)則，革蘭氏染色呈陰性.

將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示.擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)，拼接得到的16SrRNA基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)后，由MEGA7.0構(gòu)建了菌株LSM1及LYT1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4所示.菌株LYT1序列長(zhǎng)度為1431bp，在GeneBank中的登錄號(hào)為OK560662，該菌株與鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)的相似度最高(99%)，因此被鑒定為不動(dòng)桿菌屬.菌株LSM1為芽孢桿菌屬，在數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為MW485107.1.

圖2 菌株LSM1、LYT1的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Colony morphology and gram straining results of strains LSM1 and LYT1

圖3 菌株LYT1的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of strain LYT1

2.3 菌株促生性能定性測(cè)定

對(duì)菌株LSM1和LYT1進(jìn)行促生性能定性測(cè)定，包括解磷、固氮、產(chǎn)鐵載體及產(chǎn)IAA能力.各菌株促生作用測(cè)定結(jié)果如表3所列.其中LYT1在PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)，菌落周?chē)霈F(xiàn)透明的溶磷圈，如圖5所示，可初步判斷LYT1具有解磷性能.將菌株在阿須貝氏固氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，未見(jiàn)LSM1生長(zhǎng)，而LYT1可生長(zhǎng)，表明只有LYT1具有固氮能力.在產(chǎn)鐵載體測(cè)定中(見(jiàn)圖6)，兩株菌均未在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生橙黃色暈圈，表明其均無(wú)產(chǎn)鐵載體活性.如圖6可知，在產(chǎn)IAA活性測(cè)試中LSM1和LYT1都具備一定產(chǎn)IAA的能力，其中LSM1在顯色反應(yīng)中顏色更深，表示其產(chǎn)IAA能力更強(qiáng).

圖4 菌株16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain based on 16SrRNA sequence

表3 菌株促生能力定性測(cè)定

圖5 菌株的解磷能力Fig.5 Phosphorolysis capacity of the strains

2.4 菌株最佳生長(zhǎng)條件的研究

2.4.1 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

菌株LSM1和LYT1在不同pH條件下的生長(zhǎng)曲線如圖7所示，兩株菌在pH為5～9的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株對(duì)環(huán)境中的pH變化有較強(qiáng)的適應(yīng)能力.但與堿性條件(pH=9)相比，在酸性條件下(pH=5)兩株菌生長(zhǎng)受到的抑制更明顯，這與菌株分離源土壤pH值呈堿性相符.由圖7可知，LSM1與LYT1的最適生長(zhǎng)pH均為7，pH升高或降低，對(duì)于兩株菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制.

圖6 菌株的產(chǎn)IAA能力Fig.6 IAA production capacity of the strains

2.4.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

不同溫度對(duì)菌株LSM1和LYT1生長(zhǎng)的影響，如圖8所示，結(jié)果顯示，相較于pH，溫度對(duì)兩者的生長(zhǎng)影響更為顯著，在高溫和低溫環(huán)境對(duì)于兩株菌的生長(zhǎng)均有較大程度的抑制.其中LSM1對(duì)高溫更敏感，在40 ℃條件下，其生長(zhǎng)受到的抑制最明顯；低溫環(huán)境對(duì)于LYT1影響更大，在20 ℃條件下，其生長(zhǎng)最為緩慢，對(duì)數(shù)期延后.兩株菌的最適生長(zhǎng)溫度均為30 ℃，屬于中溫菌.

2.4.3 As5+對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在菌株最佳生長(zhǎng)條件下，為探明As5+濃度對(duì)高耐砷菌株生長(zhǎng)的影響，分別設(shè)定As5+濃度分別為50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1五個(gè)濃度梯度，菌株生長(zhǎng)情況如圖7所示.隨著As5+濃度不斷升高，菌株LSM1的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，濃度越高則抑制作用越顯著，在濃度為50 mg·L-1和100 mg·L-1時(shí)，菌株穩(wěn)定期縮短，在濃度為200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1時(shí)，對(duì)數(shù)期明顯延遲，表明As5+對(duì)菌株生長(zhǎng)活動(dòng)有較大影響，其最適生長(zhǎng)濃度為50 mg·L-1.而菌株LYT1則在濃度為50 mg·L-1～800 mg·L-1的范圍內(nèi)均能良好生長(zhǎng)，其受As5+的影響并不明顯，最適生長(zhǎng)濃度為100 mg·L-1，在初篩及復(fù)篩時(shí)對(duì)As3+和As5+也均表現(xiàn)出高耐受，可作為后續(xù)研究的目標(biāo)菌種.

圖7 不同pH下菌株的生長(zhǎng)情況Fig.7 Growth of strains at different pH

圖8 不同溫度下菌株的生長(zhǎng)情況Fig.8 Growth of strains at different temperatures

2.5 復(fù)合菌劑對(duì)水體中砷的去除能力

構(gòu)建復(fù)合菌劑前，首先對(duì)菌株LSM1和LYT1進(jìn)行了拮抗實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示.平板中未形成透明的抑菌圈，表明兩種菌株間不存在拮抗作用，不會(huì)抑制彼此生長(zhǎng)，因此可用于構(gòu)建復(fù)合菌劑.

在最佳生長(zhǎng)條件下，對(duì)LSM1、LYT1及復(fù)合菌劑分別進(jìn)行了As5+去除能力的測(cè)定，結(jié)果如圖9所示.菌株作用48 h時(shí)對(duì)砷的去除率均比24 h時(shí)的高，其中菌株LSM1在100 mg·L-1的As5+濃度下，去除率由24 h時(shí)的27.67%提升為46.88%.50 mg·L-1濃度下的As5+去除率均比100 mg·L-1濃度下的高，說(shuō)明較高濃度的As5+可能對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響，進(jìn)而使去除率降低.在相同時(shí)間和濃度條件下，LYT1的去除率高于LSM1.此外，復(fù)合菌劑的去除率與單一菌株的去除率之間存在顯著差異.在48 h，50 mg·L-1As5+濃度下，復(fù)合菌劑的As5+去除率可達(dá)67.40%，均大于LYT1的53.67%和LSM1的47.89%.綜上所述，當(dāng)菌株生長(zhǎng)至穩(wěn)定期(48 h)，As5+為50 mg·L-1時(shí)，菌株對(duì)砷的去除效果最好，復(fù)合菌劑的去除率均高于單菌(LYT1、LSM1).

圖9 不同As5+濃度下菌株的生長(zhǎng)情況Fig.9 Growth of strains under different As5+ concentration

圖10 菌株拮抗實(shí)驗(yàn)Fig.10 Strains antagonism experiment

圖11 不同時(shí)間下菌株對(duì)As5+的去除率Fig.11 Removal rate of As5+ by strain at different time

3 討論

本研究從分離自鐵尾礦土壤的菌株中篩選出兩株高耐砷的菌株.其中LYT1(Acinetobacterbaumannii)可耐受高達(dá)3 200 mg·L-1的As3+和6 000 mg·L-1的As5+.Blum等[18]從加利福尼亞州莫諾湖的缺氧污泥中分離到兩株革蘭氏陽(yáng)性厭氧細(xì)菌(E1H和MLS10)，均為芽孢桿菌.Suhadolnik等[19]研究了長(zhǎng)期受砷污染的熱帶沉積物中細(xì)菌多樣性，其中兼具AsV和AsⅢ抗性的菌群包括：擬衣藻屬(Dechloromonas)，速生食酸菌屬(Acidovoraxfacilis),德氏食酸菌屬(A.delafieldii).Cavalca等[20]本文利用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)砷污染根際土壤微生物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，抗砷菌株分屬于13個(gè)屬，其中以芽孢桿菌屬(Bacillus)，無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)，短波單胞菌屬(Brevundimonas)，微桿菌屬(Microbacterium)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)含量最高，大多數(shù)細(xì)菌可在高濃度砷(超過(guò)100 mmol·L-1的砷酸鹽和10 mmol·L-1的亞砷酸鹽)下生長(zhǎng).然而目前關(guān)于不動(dòng)桿菌屬的抗砷菌還鮮有報(bào)道，日后值得對(duì)該菌屬抗砷相關(guān)機(jī)制進(jìn)一步進(jìn)行研究，在土壤砷污染土壤修復(fù)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

目前已從多種重金屬污染土壤中分離出不同促生菌株.Cavalca等[20]從砷污染根際土壤中篩選得到的部分細(xì)菌具有產(chǎn)鐵載體、吲哚乙酸和1-氨基-環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的功能.曾東等[21]將從石門(mén)雄黃礦區(qū)篩得的兩株菌接種至蜈蚣草根際，蜈蚣草的增長(zhǎng)效率、根系長(zhǎng)度及地上部分含砷量均有明顯增長(zhǎng)，且菌株降低了蜈蚣草地下部分的丙二醛和脯氨酸含量，以此減輕砷對(duì)蜈蚣草的脅迫.AGELY等[22]在不同砷水平下對(duì)蜈蚣草進(jìn)行了溫室實(shí)驗(yàn)，在最高砷施用率下真菌群落增加了葉子的干質(zhì)量，并在一定范圍的磷水平上促進(jìn)了砷吸收.以上研究表明，微生物可以通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)超積累植物的生長(zhǎng)以及對(duì)污染土壤中重金屬的富集[23-26].施加促生菌株可通過(guò)改善土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)，以此促進(jìn)植物生長(zhǎng).此外，微生物一方面可以將高毒性砷轉(zhuǎn)化為低毒性砷；另一方面，植物對(duì)磷和五價(jià)砷的吸收都通過(guò)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)，因此五價(jià)砷會(huì)對(duì)植物吸收利用磷元素造成競(jìng)爭(zhēng)和拮抗，而微生物可將五價(jià)砷還原為三價(jià)砷，不受磷的競(jìng)爭(zhēng)拮抗，不影響植物攝取所需磷元素，以此促進(jìn)植物對(duì)砷的富集.本研究得到的高耐砷菌株同時(shí)具有解磷、固氮、產(chǎn)IAA活性，有望在后續(xù)研究中進(jìn)一步探究更有效的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)策略.

有關(guān)微生物應(yīng)對(duì)砷的機(jī)制包括細(xì)胞外沉淀和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化.其中細(xì)菌對(duì)砷的胞外沉淀作用包括兩個(gè)過(guò)程，一是細(xì)菌細(xì)胞壁及細(xì)菌胞外聚合物對(duì)砷的吸附，二是細(xì)菌本身通過(guò)新陳代謝作用，將重金屬累積在體內(nèi)，由此達(dá)到去除砷的目的[27].此外，微生物具有通過(guò)還原As(V)、As(III)氧化和甲基化來(lái)介導(dǎo)砷氧化還原轉(zhuǎn)化的能力[28]，因此微生物介導(dǎo)的過(guò)程可以增強(qiáng)或降低金屬遷移率和生物利用度，從而增加或減少金屬的毒性.郭盾[13]在不同pH、初始As3+和接種時(shí)間下研究了高耐砷菌株的除砷率，三株供試菌株在不同條件下的除砷率均沒(méi)有超過(guò)40%.李寶花[29]從砷污染土壤中篩選出三株菌，并對(duì)三株菌的除砷效果進(jìn)行了比較，其中菌3(假單胞菌屬)在砷濃度為100 μg·L-1的濃度下，吸附去除率為39.7%.本研究篩選獲得的菌株，構(gòu)建的復(fù)合菌劑去除率最大可達(dá)67.4%，高于前人報(bào)道的去除率.綜上所述，本研究篩選獲得的菌株對(duì)砷的耐受和去除均有較強(qiáng)的能力，并對(duì)高砷土壤環(huán)境中的植物生長(zhǎng)具有潛在的促生作用，在砷污染土壤的微生物-植物聯(lián)合修復(fù)研究領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景.

4 結(jié)論

本研究從實(shí)驗(yàn)室保存及分離自甘肅省臨澤縣鐵尾礦土壤的11株菌株中，篩選馴化出兩株高耐砷菌株.其中菌株LSM1分別可耐受3 000 mg·L-1的As3+和5 500 mg·L-1的As5+，菌株LYT1分別可耐受3 200 mg·L-1的As3+和6 000 mg·L-1的As5+.菌株LSM1為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)，具有產(chǎn)IAA活性；經(jīng)16SrRNA基因鑒定，菌株LYT1為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)，具有解磷、固氮、產(chǎn)IAA的促生作用.LSM1的最佳生長(zhǎng)條件為pH=7、30 ℃、As5+50 mg·L-1，LYT1的最佳生長(zhǎng)條件為pH=7、30 ℃、As5+100 mg·L-1.在最適生長(zhǎng)條件下，復(fù)合菌劑的去除率均大于單一菌株的去除率，在50 mg·L-1的As5+濃度下培養(yǎng)48 h時(shí)砷去除率達(dá)到最大，為67.40%.在同一濃度不同時(shí)間下，48 h的砷去除率均高于24 h時(shí)的去除率；在同一時(shí)間不同濃度下，As5+為50 mg·L-1時(shí)的砷去除率均高于100 mg·L-1時(shí)的去除率.在同一時(shí)間和濃度下，LYT1的As5+去除率高于LSM1，兩者在48 h、50 mg·L-1As5+濃度下的去除率分別為53.67%和47.89%.以上研究結(jié)果可為后續(xù)高耐砷菌株聯(lián)合植物修復(fù)砷污染土壤提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源，可為后續(xù)研究耐砷菌株的抗砷機(jī)制奠定理論基礎(chǔ).