王嘉歡，陳曉杰，張福彥，范家霖，楊保安，程仲杰，張建偉

（河南省科學院同位素研究所有限責任公司/河南省核農(nóng)重點實驗室，鄭州 450015）

表皮蠟質(zhì)是陸生植物地上部分的第一道物理屏障，在植物與環(huán)境的相互作用過程中，應對各種多變的環(huán)境脅迫時扮演著重要的角色［1］.表皮蠟質(zhì)可以保護植物免受強紫外線輻射和高溫的危害［2］，增加植物對高鹽和低溫的耐受性，還可以抵御外界病蟲害和食草動物的侵害［3-5］，限制植物的非氣孔水分流失［6-7］，另外，表皮蠟質(zhì)還與植物抗旱性及產(chǎn)量密切正相關［2，8-10］.不同植物表皮中的蠟質(zhì)成分是不同，例如在番茄的葉片和果實中，蠟質(zhì)主要成分為直連烷烴、支鏈烷烴、脂肪醇和三萜類等化合物［11］，而荷葉表皮中蠟質(zhì)成分重要為長鏈直鏈二醇、長鏈次級醇、伯醇以及脂肪酸等化合物［12］.禾本科植物表皮蠟質(zhì)化學組成主要有烷烴類、醛類、醇類、酸類、酯類、酮類、萜類及其他一些未知成分［13］.

小麥（Triticum aestivumL.）是在全球溫帶地區(qū)種植的最重要的糧食作物之一.小麥蠟質(zhì)是指覆蓋在小麥表皮細胞外的一層由親脂性化合物構成的疏水層，小麥的葉、莖、穗和芒等部位表面均被蠟質(zhì)層覆蓋，其表皮有大量的蠟質(zhì).小麥蠟質(zhì)主要成分是超長鏈脂肪酸及其衍生物，包括初級醇、烷烴、醛、脂肪酸、β-和OH-β-二酮［14-16］.蠟質(zhì)組分在小麥不同器官是不同的，小麥葉片表皮蠟質(zhì)主要組分是初級醇，葉鞘和莖表皮蠟質(zhì)主要組分是β-二酮［17-18］.β-二酮主要為正三十一烷-14、16-二酮，由于β-二酮的存在，許多現(xiàn)代小麥品種表現(xiàn)出白霜狀蠟質(zhì)外觀.

雖然有關小麥表皮蠟質(zhì)組成的研究已經(jīng)較多，但大多數(shù)研究關注于小麥的葉片，對穗部的研究較少.小麥穗部作為重要的光合器官，對產(chǎn)量有直接貢獻，目前尚不清楚不同品種小麥穗部表皮蠟質(zhì)組成的差異.因此，為了了解小麥穗部表皮蠟質(zhì)的組成特點，并獲得小麥穗部表皮蠟質(zhì)的含量及成分數(shù)據(jù)，本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對四種不同現(xiàn)代品種小麥材料的穗部表皮蠟質(zhì)進行測定和分析，獲得小麥蠟質(zhì)組成成分特征和品種間差異，為后續(xù)研究小麥蠟質(zhì)分子機理提供基礎.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯仿（英豐，中國）、正二十四烷烴、吡啶和雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）均購自美國的西格瑪奧德里奇公司.主要儀器有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B，安捷倫，美國）、氣相色譜樣品瓶（安捷倫，美國）、容量瓶（天玻，中國），千分之一分析天平（BSA224S，賽多利斯，德國）、恒溫水浴鍋（DZKW-C，樹立，中國）、氮吹儀（LC-DCY-12G，力辰，中國）、烘干箱（DHG-9246A，精宏，中國）.

1.2 試驗材料

洛旱17、鄭品麥22號、中育1331、齊民7號四個小麥品種，于2020年10月15日種植于鄭州市新鄭市新村鎮(zhèn)小麥試驗基地（34°39′N 113°74′E）.每個品種的小麥以10 cm的間距人工點播種植在行長為1.5 m、行距25 cm的試驗田中.2021年4月20日選取樣品，用干凈的剪刀選取揚花期的小麥穗部，然后保存于4℃冰箱中用于后續(xù)實驗.

1.3 標準品配制

用千分之一分析天平準確稱取0.05 g正二十四烷烴（C24）標準品于50 mL容量瓶中，加入50 mL氯仿溶液配制成質(zhì)量濃度為1 μg/μL的標準品液，密封后置于4℃冰箱保存.

1.4 氯仿浸提法提取小麥穗部表皮蠟質(zhì)

將新鮮干凈的小麥穗子放于提前用氯仿潤洗過的小燒杯中，加入25～35 mL氯仿，使組織完全浸沒在氯仿中，然后加入20 μL正二十四烷烴（C24，1 μg/μL）作為內(nèi)標，輕輕晃動燒杯，浸提60 s.浸提完后，用干凈的鑷子撈出組織，將提取后的組織放入烘箱中烘干24 h后測定其干重，將浸提液放置于通風櫥中使其揮發(fā)變少.將揮發(fā)后的提取液（10 mL）通過濾紙過濾到小玻璃瓶中，然后置于通風櫥中完全揮發(fā).加入1 mL的氯仿于小玻璃瓶中，然后轉入氣相色譜樣品瓶中，置于通風櫥中使其完全揮發(fā).

1.5 蠟質(zhì)提取物的衍生化反應

為了使提取到的蠟質(zhì)能被氣相色譜（Gas chromatography，GC）充分檢測到，需先進行衍生反應.衍生反應的目的是將含有羥基（OH-）的化合物轉化為其相應的三甲基甲硅烷基衍生物［19］.具體步驟是：將樣品在氮氣下干燥，然后加入40 μL的BSTFA和40 μL吡啶，將GC小瓶蓋好蓋子，并將混合物置于70℃金屬浴中60 min，然后迅速在氮氣下吹干反應物，最后加入800 μL的氯仿用于下一步GC的測定.

1.6 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析蠟質(zhì)成分

配備有質(zhì)譜檢測器（Mass spectrometer，MS）和火焰離子化檢測器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID）的GC分別用于組合物定性和定量分析.小麥蠟質(zhì)提取物的成分在毛細管柱HP-1（長度30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚度0.25 μm；安捷倫，美國）上進行分析，并連接至FID，載氣位氮氣，進樣體積1 μL，SPL1氣化室溫度為305℃、檢測器溫度為310℃、色譜柱流量為2 mL/min.溫度程序如下：在50℃下保持2 min；然后以20℃/min的速度升溫至220℃，保持2 min；接著以4℃/min的速度升溫至310℃，然后在310℃保持5 min.

在與上述相同的GC條件下使用GC-MS對樣品進行定量分析，但調(diào)節(jié)載氣為氦氣，氦氣的流速為2.00 mL/min.掃描模式為全掃描模式，掃描的范圍為35～700 m/z.

1.7 數(shù)據(jù)分析

基于每種化合物的峰面積和C24的峰面積計算每種蠟質(zhì)組分的含量.所有小麥樣品一式三份進行分析，每三個樣品的方差系數(shù)（C.V.）小于15%.采用SIGMA PLOT 14.0作圖后進行數(shù)據(jù)分析.

2 結果與分析

2.1 小麥蠟質(zhì)表型分析

通過觀察四個品種小麥揚花期的穗部蠟質(zhì)表型（圖1），發(fā)現(xiàn)洛旱17表型為淡綠色，鄭品麥22、中育1331和齊民7號的表型都有不同程度的白霜狀蠟質(zhì)覆蓋，其中鄭品麥22白霜狀較少，中育1331次之，齊民7號的白霜狀蠟質(zhì)層最厚.這些表型說明，不同品種的小麥穗部表皮蠟質(zhì)存在差異，需進一步進行成分鑒定.

圖1 四個小麥品種蠟質(zhì)表型Fig.1 Cuticular wax phenotypes of four wheat varieties

2.2 小麥蠟質(zhì)成分鑒定

洛旱17、鄭品麥22、中育1331、齊民7號氣相色譜圖見圖2，通過GC-MS得到其離子峰，并借助質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和文獻數(shù)據(jù)檢索來鑒定各個蠟質(zhì)的組分［15］.四個小麥品種中均檢測出了不同的蠟質(zhì)成分，每一個品種小麥（除洛旱17外）表皮蠟質(zhì)提取物中均鑒定出了16種成分（圖2）.洛旱17表皮蠟質(zhì)提取物中鑒定到了15種化學成分，比其他三個品種的蠟質(zhì)少一種，即31-OH-β-二酮.鑒定到的這些成分包括四大類：烷烴、初級醇、脂肪醛和二酮.這四大類化學成分各由不同長度碳鏈組成，其中烷烴均由奇數(shù)碳鏈組成，碳鏈長度為25～33；初級醇均由偶數(shù)碳鏈組成，碳鏈長度22～30；脂肪醛均由偶數(shù)碳鏈組成，碳鏈長度24～28；而二酮則由單一碳鏈組成，碳鏈長度為31，由31-β-二酮和31-OH-β-二酮組成.通過氣相色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，不同的品種間的蠟質(zhì)組分存在差異.

圖2 四個小麥品種蠟質(zhì)氣相色譜圖Fig.2 GC chromatograms of cuticular wax of four wheat varieties

2.3 小麥蠟質(zhì)各組分同系物含量分析

通過進一步定量分析，發(fā)現(xiàn)四個小麥品種的蠟質(zhì)各組分同系物絕對含量w之間存在較大差異.在洛旱17的穗部各蠟質(zhì)組分中，烷烴由5種不同鏈長組成，其中二十九烷烴占主導地位，w=（70.7±0.9）μg/g，二十七烷烴次之，三十一烷烴和二十五烷烴含量相當，三十三烷烴最低.初級醇的各組分也存在差異，其中二十六醇含量最高，w=（177.0±14.8）μg/g，二十八醇、二十四醇和三十醇含量較低，而二十二醇最低.脂肪醛的各組分差異較小，與其他組分相比含量較低，其中二十八醛含量最高，w僅為（14.0±0.7）μg/g，二十四醛、二十八醛以及三十醛的含量較低.另外，比較特殊的是在洛旱17的表皮蠟質(zhì)中，僅檢測到了31-β-二酮，w=（135.9±14.0）μg/g，而未檢測到OH-β-二酮，其他的三個小麥材料中則同時檢測到了β-二酮和OH-β-二酮（圖3）.從總體組分上來看，洛旱17表皮蠟質(zhì)中二十六醇含量占絕對優(yōu)勢，β-二酮含量次之，隨后是二十九烷烴，而脂肪醛的各組分含量均較少.

圖3 四個小麥品種蠟質(zhì)各組分含量Fig.3 Content of individual wax constituent of four wheat varieties

鄭品麥22和中育1331穗部的各蠟質(zhì)組分的分布規(guī)律接近且不同于洛旱17，在這兩個品種的初級醇組分中，二十四醇的含量均占主導地位，w分別達到了（23.4±1.9）μg/g和（67.3±5.6）μg/g，三十醇的含量次之，其他鏈長的初級醇含量都較低.在脂肪醛的各組分中，三十醛的含量最高，w分別為（11.2±0.2）μg/g和（18.5±1.6）μg/g，二十六醛次之，其他醛的含量都很低.在二酮的各組分中，這兩個品種的β-二酮的含量較高且較為接近，w分別為（35.4±1.5）μg/g和（36.8±2.5）μg/g，而OH-β-二酮的含量較低，w分別為（18.4±0.8）μg/g和（32.5±1.7）μg/g.值得注意的是，中育1331表皮蠟質(zhì)中的OH-β-二酮的含量是鄭品麥22的1.8倍.另外，稍有不同的是，鄭品麥22和中育1331表皮蠟質(zhì)中的烷烴分布不一樣，在鄭品麥22的穗部表皮蠟質(zhì)中，三十一烷烴含量最高，w=（144.1±9.0）μg/g，二十九烷烴次之，其他鏈長的烷烴含量較低，其中二十五烷烴含量最低；而在中育1331中，二十九烷烴含量最高，w=（130.8±6.6）μg/g，三十一烷烴次之，其他鏈長的烷烴含量較低，二十五烷烴含量最低.從總體組分上來看，鄭品麥22和中育1331表皮蠟質(zhì)中二十九烷烴或三十一烷烴含量占絕對優(yōu)勢，31-β-二酮或二十四醇的含量次之，而脂肪醛的各組分含量均較少.

齊民7號的穗部表皮蠟質(zhì)中的烷烴各組分分布與鄭品麥22類似，都是三十一烷烴含量最高，二十九烷烴次之，二十五烷烴含量最低.齊民7號表皮蠟質(zhì)中的初級醇的各組分則與其他三個材料的分布都不同，其中二十六醇含量最高，二十二醇和三十醇含量次之，而二十四醇含量最低；同樣的，在脂肪醛的各組分含量均比較低，其中二十八醛含量最高，二十六醛含量最低.齊民7號與其他材料明顯不一樣的地方是蠟質(zhì)組分中有大量的二酮，其中w（31-β-二酮）高達（375.7±24.7）μg/g，是其他三個材料的2.8～10.6倍；w（31-OH-β-二酮）也很高，達到了（116.7±15.3）μg/g，分別是鄭品麥22號和中育1331的6.4倍和3.6倍.從總體組分上來看，齊民7號的表皮蠟質(zhì)中β-二酮和OH-β-二酮含量占絕對優(yōu)勢，二十六醇的含量次之，而脂肪醛的各組分含量均較少.

2.4 小麥蠟質(zhì)各組分總量分析

通過分析四個品種小麥穗部蠟質(zhì)各組分同系物含量得到了各組分總量及相對含量，結果見表1.

表1 四個小麥品種表皮蠟質(zhì)各組分的絕對含量和相對含量Tab.1 Absolute and relative contents of individual wax constituent of four wheat varieties

結果顯示，齊民7號的蠟質(zhì)總量最高，為（1 021.2±55.3）μg/g，洛旱17和中育1331的蠟質(zhì)總量較為接近，而鄭品麥22的蠟質(zhì)總量最低，為（431.1±20.2）μg/g.在這四個品種穗部表皮蠟質(zhì)中，脂肪醛的總量均比較低，相對含量范圍為4.4%～8.0%，而其他組分含量則差異較大.雖然洛旱17和中育1331的蠟質(zhì)總量接近，但是兩個品種各組分總量差異很大，洛旱17的初級醇絕對含量最高，達到了（218.7±15）μg/g（相對含量為38.5%），且比其他三個材料初級醇的含量都高；而中育1331則是烷烴總量最高，相對含量達到59.7%，初級醇絕對含量較低，為（107.3±6.5）μg/g.鄭品麥22中烷烴占主導地位，相對含量達到了72.1%.而在齊民7號中，二酮絕對含量最高，為（492.4±40）μg/g，相對含量達到了48.2%.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同品種的小麥穗部表皮蠟質(zhì)組分及含量是不同的，即便表皮蠟質(zhì)總量接近，各組分也存在差異.另外，先前的研究往往認為有白霜狀表型的材料為高蠟質(zhì)材料，有淡綠色表型的材料為低蠟質(zhì)材料.而本研究發(fā)現(xiàn)，淡綠色表型的洛旱17蠟質(zhì)總量并不是最低的，它的表皮蠟質(zhì)中沒有OH-β-二酮.白霜狀表型的鄭品麥22、中育1331、齊民7號的OH-β-二酮含量則依次增高，這與小麥的蠟質(zhì)表型也有一定的對應關系.因此，可以根據(jù)小麥是否有白霜狀表型來確定小麥是否含有OH-β-二酮，而不能根據(jù)表型簡單的定義低蠟和高蠟材料.由此也可以推斷OH-β-二酮是導致小麥呈現(xiàn)白霜狀表型的主要化合物.

雖然在越來越多的禾本科植物中發(fā)現(xiàn)了β-二酮和OH-β-二酮［19-21］，關于二酮基因的定位及分子機制的研究也越來越多［22-24］，但是仍舊缺乏對其生物活性及其潛在機制的更廣泛理解.因此，基于上述討論，本文章的4個不同品種的小麥材料可以作為用于進一步研究β-二酮和OH-β-二酮生物合成的合適材料，未來的研究需要更多的生理和基因功能實驗來進一步闡明二酮合成的機理.