李 濤，劉曉艷，王楠楠，楊紹青，韓 冬，江正強(qiáng),*

（1.中國(guó)輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

衰老是指器官和組織的功能隨時(shí)間變化而衰退，是導(dǎo)致許多疾病的最大危險(xiǎn)因素，包括一些神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病[1]。構(gòu)成細(xì)胞和組織的大分子（如核酸、脂類、糖和蛋白質(zhì)）受到超氧化物和其他自由基不同程度的氧化會(huì)引起氧化損傷，造成機(jī)體多器官、多系統(tǒng)的功能減退，進(jìn)而導(dǎo)致疾病和衰老[2]。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是衰老的一種早期現(xiàn)象。近年來，人們不斷尋求具有減緩氧化應(yīng)激損傷作用的天然活性成分[3]。

益生元可被腸道微生物代謝，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，特別是短鏈脂肪酸進(jìn)入腸道會(huì)影響宿主生理健康[4]。研究表明，從果蔬、海藻、菌菇類和中藥材中提取的多糖可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活力、提高機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)、激活衰老相關(guān)蛋白信號(hào)通路等達(dá)到延緩衰老的作用[5-7]。從藻類石莼和滸苔中提取的寡糖可通過減輕氧化損傷、保護(hù)腦神經(jīng)元、降低炎癥因子水平和調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因等抑制小鼠衰老[8]。牟婕等[9]研究表明褐藻膠寡糖能夠抑制p53/p21信號(hào)通路，從而上調(diào)衰老心肌細(xì)胞自噬水平延緩其衰老。

香豆（Trigonella foenum-graecumL.）屬豆科一年生草本植物，在北非、地中海國(guó)家及印度、加拿大廣泛種植。香豆中含有黃酮類化合物、生物堿、氨基酸、香豆素、維生素、皂苷等生物活性成分[10]。同時(shí)，香豆中含有約26.8%可溶性纖維，即香豆膠，化學(xué)結(jié)構(gòu)上主要為半乳甘露聚糖[11]，其中甘露糖和半乳糖的質(zhì)量比為1∶1[12]。半乳甘露聚糖是直線狀(1,4)-β-D型甘露糖骨干于6-連接點(diǎn)連接到α-D型半乳糖的多糖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)攝入香豆膠中的半乳甘露聚糖可改善脂質(zhì)、降低血壓及血清膽固醇水平，促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌增殖、維持腸內(nèi)菌群平衡[13]。與香豆膠相比，利用甘露聚糖酶水解香豆膠制備鏈長(zhǎng)較短、溶液黏度較低的甘露聚糖水解物可提升其益生功效。研究表明β-甘露聚糖酶水解槐豆膠、田菁膠和魔芋膠等制備的甘露寡糖能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活力、抑制慢性炎癥和氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和腸道菌群等[14-16]。甘露聚糖酶部分水解瓜爾豆膠的產(chǎn)物可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和恢復(fù)腸道微生物群改善D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠衰老[17]。國(guó)內(nèi)外對(duì)香豆膠的功能研究多集中于促消化、助泌乳、抗菌、抗氧化、抗糖尿病、抗癌、保肝、護(hù)神經(jīng)等藥理作用[18-20]，鮮見部分水解香豆膠抗衰老作用的報(bào)道。

本研究利用β-甘露聚糖酶水解香豆膠制備部分水解香豆膠[21]，建立自然衰老模型觀察其抗衰老作用，并初步探討其抗衰老機(jī)理，旨在為研發(fā)天然抗衰老食品配料提供新資源和研究參考，為進(jìn)一步開發(fā)和利用香豆膠提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

60只7～8 月齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量為27～35 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。普通維持飼料，含有碳水化合物50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）、脂肪10%、蛋白質(zhì)20%，由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0003。

香豆膠 北京瓜爾潤(rùn)科技股份有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物科技公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）、乳酸、晚期糖基化終末產(chǎn)物、端粒酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 北京華英生物技術(shù)研究所；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體、神經(jīng)元標(biāo)志物（neuronal nuclei，NeuN）抗體、腫瘤抑制蛋白p53、腫瘤抑制蛋白p16 英國(guó)Abcam公司；山羊抗兔IgG抗體 艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；RNA 9767提取試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix RR036A和TB Green Premix ExTaqII試劑盒日本Takara公司； BCA蛋白檢測(cè)試劑盒 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

華衛(wèi)德朗DR-200BS酶標(biāo)儀 無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；Ci-S倒置顯微鏡 日本尼康株式會(huì)社；ABX pentra 60全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀 堀場(chǎng)醫(yī)療（法國(guó)）有限公司；BM-19AY激光共聚焦顯微鏡 上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；CFX系列實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，q-PCR）儀伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 部分水解香豆膠的制備

稱取香豆膠100 g，加入去離子水常溫下配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的香豆膠溶液。然后加入β-甘露聚糖酶（1 000 U/g），35 ℃水解12 h，沸水浴20 min滅酶。酶解液經(jīng)10 000 r/min離心5 min，取上清液真空冷凍干燥，得到部分水解香豆膠的樣品（水解率為82.2%，純度≥90%）。其成分為聚合度在2～6之間的甘露寡糖（占35.6%）和大量聚合度大于6的甘露聚糖；平均聚合度不高于10，重均分子質(zhì)量為1.8h103Da[21]。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理

C57BL/6J小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25f5）℃、相對(duì)濕度（50f10）%、燈光始終12 h明暗交替（7∶00至19∶00為白晝時(shí)間、19∶00至次日7∶00為黑夜時(shí)間）。所有小鼠均飼喂普通維持飼料，飲用水為蒸餾水，保持小鼠自由飲水及攝食。經(jīng)過2周適應(yīng)期后，將小鼠隨機(jī)分為3 組（n＝20）：自然衰老組、陽性對(duì)照藥物干預(yù)組（二甲雙胍）、部分水解香豆膠干預(yù)組。為了最小化其他因素對(duì)小鼠壽命的影響，本實(shí)驗(yàn)將樣品添加在水中，二甲雙胍添加量為0.3 g/L，部分水解香豆膠添加量為3 g/L。

飼養(yǎng)期間每周同一時(shí)間稱量小鼠體質(zhì)量，并進(jìn)行衰老評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：對(duì)小鼠外觀衰老（皮毛粗糙度、脫毛程度）、組織病變（皮膚潰病、眼周損傷）、體態(tài)衰老（脊柱后凸）、反應(yīng)退化（反應(yīng)性）程度6 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，每項(xiàng)指標(biāo)打分范圍為0～10 分。根據(jù)嚴(yán)重程度不同，客觀評(píng)分，分值越高則老化度越高[22]。

實(shí)驗(yàn)周期12 個(gè)月結(jié)束后小鼠禁食16 h，摘出眼球，收集血液樣品，3 500 r/min、4 ℃離心15 min后分離血清，保存于－80 ℃冰箱。快速解剖取出大腦和肝臟等組織，用生理鹽水清洗組織。用濾紙吸干后，稱質(zhì)量。部分樣品固定于體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液中，保存在4 ℃冰箱，用于形態(tài)觀察；部分樣品凍存于－80 ℃冰箱，用于后續(xù)指標(biāo)分析。

1.3.3 組織形態(tài)觀察

解剖小鼠，取大腦、肝臟、腎臟和結(jié)腸組織，放入10%中性福爾馬林溶液進(jìn)行固定，固定48 h后進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片，用倒置顯微鏡觀察HE染色組織切片。

1.3.4 代謝產(chǎn)物水平測(cè)定

利用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血清中的代謝產(chǎn)物水平，代謝產(chǎn)物具體包括肌酐、清蛋白、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及膽固醇。

1.3.5 衰老標(biāo)志物水平測(cè)定

通過ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中衰老標(biāo)志物水平，標(biāo)志物包括一氧化氮（NO）、乳酸、晚期糖基化終末產(chǎn)物、端粒酶。

1.3.6 抗氧化能力測(cè)定

取小鼠血清，按照1∶4（V/V）的比例加入生理鹽水，混勻后2 500 r/min離心10 min，取上清液待用。T-AOC、MDA含量和CAT、GSH-Px活力的測(cè)定均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.7 免疫熒光檢測(cè)

小鼠大腦組織經(jīng)體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定后，進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟和抗原修復(fù)，用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）奶粉室溫封閉處理1 h。采用1∶100稀釋BDNF和NeuN抗體室溫避光處理1 h。用1%奶粉清洗3 遍，每次10 min。將山羊抗兔IgG抗體按稀釋比1∶200于5%奶粉中稀釋，室溫避光處理1 h。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）室溫避光清洗3 遍，每次10 min。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液處理15 min，PBS室溫避光清洗1 遍，加一滴甘油，用蓋玻片覆蓋于載玻片上，指甲油密封蓋玻片和載玻片間的縫隙，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。通過Image J軟件分析綠色熒光可分別得出大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量、海馬CA1區(qū)BDNF陽性細(xì)胞率。

1.3.8 p53/p21/p16信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)分析

使用Takara RNA 9767提取試劑盒，從大腦、肝臟組織中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix RR036A試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用TB Green Premix ExTaqII試劑盒，以cDNA作為模板，分析mRNA表達(dá)水平。qPCR程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 s。55～95 ℃逐步獲得熔解曲線。在通過基因β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后，使用2－ΔΔCt比較方法分析靶基因的表達(dá)量。靶基因的引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 qPCR分析的靶基因引物序列Table 1 Primer sequences of target gene used for quantitative realtime polymerase chain reaction

冷凍肝臟組織使用RIPA裂解液裂解均質(zhì)，然后離心收集上層清液。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將等量的蛋白樣品（20 μg）分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上。然后，膜與一抗（腫瘤抑制蛋白p53、p16，1∶1 000）在4 ℃下過夜。用洗滌緩沖液（TBST）洗滌后，用二抗（1∶5 000）孵育1 h，用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)行定量。以β-actin作為內(nèi)參。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS statistics 23.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。組間數(shù)據(jù)的顯著性分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的Tukey’s多重比較進(jìn)行。P＜0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著差異，P＜0.01表示數(shù)據(jù)具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠體質(zhì)量、組織質(zhì)量和存活率的影響

由圖1A可知，二甲雙胍長(zhǎng)時(shí)間干預(yù)可引起衰老小鼠體質(zhì)量增加，但差異不顯著（P＞0.05）。部分水解香豆膠干預(yù)5 個(gè)月過程中對(duì)衰老小鼠體質(zhì)量無顯著影響，而干預(yù)6～8 個(gè)月體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；超過9 個(gè)月后，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分水解香豆膠干預(yù)組小鼠體質(zhì)量逐漸降低。相比自然衰老組，部分水解香豆膠和二甲雙胍干預(yù)組衰老小鼠的腎臟及脂肪組織的質(zhì)量均降低。同時(shí)，經(jīng)部分水解香豆膠處理后，大腦、心臟、肝臟和脾臟的質(zhì)量分別增加2.0%、21.4%（P＜0.01）、4.2%和11.1%（圖1B）。由圖1C可知，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預(yù)組衰老小鼠的存活率均高于自然衰老組，在第12個(gè)月時(shí)分別提高了33.3%和25.0%。

圖1 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠體質(zhì)量（A）、組織質(zhì)量（B）和存活率（C）的影響Fig. 1 Effects of partially hydrolyzed fenugreek gum on body mass (A),visceral tissue mass (B) and survival rate (C) of aging mice

2.2 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠衰老評(píng)分的影響

如表2～4所示，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預(yù)衰老小鼠9 個(gè)月的過程中，自然衰老小鼠與二甲雙胍和部分水解香豆膠干預(yù)組小鼠在反應(yīng)性、皮毛粗糙度、脫毛程度、皮膚潰病、眼周損傷和脊柱后凸方面均沒有顯著變化。而干預(yù)12 個(gè)月后（表5），與自然衰老組小鼠相比，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預(yù)均能降低衰老小鼠的衰老程度，其中部分水解香豆膠干預(yù)組小鼠的反應(yīng)性、脫毛程度和脊柱后凸顯著改善（P＜0.05）。

表2 部分水解香豆膠干預(yù)3 個(gè)月對(duì)衰老小鼠衰老評(píng)分的影響Table 2 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum treatment for three months on aging scores of aging mice

表3 部分水解香豆膠干預(yù)6 個(gè)月對(duì)衰老小鼠衰老評(píng)分的影響Table 3 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum treatment for six months on aging scores of aging mice

表4 部分水解香豆膠干預(yù)9 個(gè)月對(duì)衰老小鼠衰老評(píng)分的影響Table 4 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum treatment for nine months on aging scores of aging mice

表5 部分水解香豆膠干預(yù)12 個(gè)月對(duì)衰老小鼠衰老評(píng)分的影響Table 5 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum treatment for 12 months on aging scores of aging mice

2.3 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠組織形態(tài)的影響

由圖2A可知，自然衰老組小鼠大腦海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞（黑色箭頭）排列疏松散亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)核膜皺縮與結(jié)構(gòu)不清晰的現(xiàn)象，同時(shí)部分細(xì)胞形狀發(fā)生改變，呈現(xiàn)不規(guī)則齒狀形態(tài)。與自然衰老小鼠相比，部分水解香豆膠干預(yù)組錐體細(xì)胞有3～4 層，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)較完整，核仁清晰；二甲雙胍干預(yù)組錐體細(xì)胞有4～5 層，排列更為整齊緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞凋亡及核固縮現(xiàn)象極少。肝臟組織細(xì)胞的破壞與減少是機(jī)體衰老的癥狀之一。自然衰老小鼠肝細(xì)胞排列松散，細(xì)胞質(zhì)中有不同大小的液泡，出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。然而，經(jīng)過二甲雙胍和部分水解香豆膠處理后，肝臟組織形態(tài)學(xué)明顯改善，其中肝細(xì)胞變得密集，表現(xiàn)出完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和清晰的細(xì)胞邊界，未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。腎臟是人體的解毒器官，自然衰老小鼠腎組織病理學(xué)分析顯示腎小球明顯萎縮，腎近曲小管球囊增寬、上皮細(xì)胞脫落，同時(shí)出現(xiàn)腎水腫現(xiàn)象。與自然衰老小鼠相比，二甲雙胍處理明顯改善了腎臟組織形態(tài)；部分水解香豆膠干預(yù)抑制了腎小球萎縮和腎近曲小管球囊增寬，腎水腫現(xiàn)象減弱。

由圖2B可知，自然衰老組小鼠結(jié)腸絨毛長(zhǎng)度縮短，出現(xiàn)明顯皺縮，且數(shù)量稀疏。與自然衰老小鼠相比，部分水解香豆膠干預(yù)組的小鼠結(jié)腸絨毛整齊、稠密，絨毛長(zhǎng)度和肌層厚度極顯著增加（P＜0.01），分別增加了32.2%和54.1%；同時(shí)，部分水解香豆膠干預(yù)極顯著降低了自然衰老小鼠結(jié)腸組織隱窩深度（P＜0.01）（圖2C）。綜上所述，部分水解香豆膠能夠改善衰老小鼠的組織形態(tài)。

圖2 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠組織形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum on tissue morphology of aging mice

2.4 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠血清指標(biāo)的影響

由表6可知，與自然衰老組相比，部分水解香豆膠干預(yù)降低了小鼠血清中肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和膽固醇水平，分別降低了40.1%、15.7%、29.5%（P＜0.01）和20.0%（P＜0.05）。同時(shí)，部分水解香豆膠干預(yù)組小鼠血清中清蛋白質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05）。與自然衰老組相比，部分水解香豆膠干預(yù)組小鼠血清中一氧化氮、乳酸和晚期糖基化終末產(chǎn)物水平分別下降了26.2%、29.5%（P＜0.05）、47.8%（P＜0.01）；端粒酶活力則顯著增加了65.1%（P＜0.05）。與自然衰老組相比，部分水解香豆膠干預(yù)12 個(gè)月后，衰老小鼠血清中T-AOC、CAT活力及GSH-Px活力分別提高了78.1%（P＜0.05）、122.9%（P＜0.01）和2.7%；與自然衰老組相比，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預(yù)組MDA濃度分別降低31.5%（P＜0.05）和40.3%（P＜0.01）。

2.5 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)量和海馬CA1區(qū)BDNF表達(dá)的影響

如圖3A1所示，與自然衰老小鼠相比，部分水解香豆膠顯著降低了衰老小鼠大腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷，神經(jīng)元數(shù)量分別增加了78.7%（P＜0.01）和50.0%（圖3A2）。如圖3B所示，與自然衰老小鼠相比，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預(yù)后小鼠海馬CA1區(qū)中BDNF陽性細(xì)胞率分別增加了144.6%（P＜0.01）和85.7%（P＜0.05）。結(jié)果表明部分水解香豆膠可通過上調(diào)衰老小鼠海馬CA1區(qū)中BDNF表達(dá)促進(jìn)其神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育。

表6 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠血清指標(biāo)的影響Table 6 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum on serum metabolite indexes of aging mice

圖3 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)量和海馬CA1區(qū)BDNF表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum on the number of neurons in brain tissue and BDNF expression in the hippocampus CA1 area of aging mice

2.6 部分水解香豆膠對(duì)衰老小鼠衰老相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

如圖4A所示，與自然衰老小鼠相比，部分水解香豆膠抑制了大腦組織中p16、p21和p53mRNA的表達(dá)。如圖4B所示，部分水解香豆膠干預(yù)會(huì)下調(diào)衰老小鼠肝臟組織中p16、p21和p53mRNA的表達(dá)，降低量分別為16.8%（P＜0.05）、13.5%和19.1%（P＜0.05）。如圖4C所示，部分水解香豆膠干預(yù)顯著下調(diào)衰老小鼠肝臟組織中p16和p53蛋白的表達(dá)，降低量分別為24.0%（P＜0.05）和69.3%（P＜0.01）。結(jié)果表明，部分水解香豆膠抑制了衰老小鼠大腦、肝臟組織中p53/p21/p16信號(hào)通路的表達(dá)。

圖4 部分水解香豆膠對(duì)衰老相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum on gene and protein expression related to aging

3 討 論

大量研究表明，衰老會(huì)增加機(jī)體氧化應(yīng)激與組織器官損傷，降低端粒酶活性，加劇神經(jīng)細(xì)胞老化或凋亡等[14,23]。目前已經(jīng)證明多種益生元具有抗衰老的作用[5-9]。研究表明魔芋來源的甘露寡糖具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善組織形態(tài)及調(diào)控脂代謝等作用[24]。香豆膠含有豐富的半乳甘露聚糖，本實(shí)驗(yàn)利用β-甘露聚糖酶將香豆膠水解為部分甘露聚糖水解物，探討部分水解香豆膠對(duì)自然衰老小鼠的抗衰老作用及其分子機(jī)制。

老鼠在衰老過程中會(huì)逐漸表現(xiàn)出四肢無力、反應(yīng)性下降、毛色發(fā)黃、無光澤甚至脫毛現(xiàn)象[25]。本研究表明，膳食補(bǔ)充部分水解香豆膠增加了衰老小鼠的存活率（圖1C），且明顯改善其反應(yīng)性、脫毛程度和脊柱后凸（表5）。由此可知，部分水解香豆膠對(duì)于減輕小鼠衰老特征發(fā)揮了積極的干預(yù)作用，具有一定的抗衰老潛力。衰老是一個(gè)涉及器官損傷的過程[8]。部分水解香豆膠抑制了脂肪組織堆積（圖1B），改善了衰老小鼠大腦、肝臟、腎臟和結(jié)腸組織的形態(tài)（圖2）。同時(shí)，小鼠在衰老狀態(tài)下組織器官的損傷導(dǎo)致其血清中肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和膽固醇水平顯著升高[26]，而經(jīng)部分水解香豆膠飲食干預(yù)后其水平均降低（表6）。這可能由于水解物中的甘露寡糖成分調(diào)節(jié)了機(jī)體內(nèi)細(xì)胞代謝和抑制了核因子（nuclear fator，NF）-κB信號(hào)通路減輕器官的炎癥反應(yīng)進(jìn)而保護(hù)了其組織器官[27]。研究表明魔芋來源的甘露寡糖直接和參與腸肝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞相互作用，間接影響膽固醇等代謝產(chǎn)物[28]。

衰老過程伴隨著自由基的過量產(chǎn)生和晚期糖基化終末產(chǎn)物的緩慢形成[29]。過多的晚期糖基化終末產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致NO的產(chǎn)生；NO與自由基相互作用，形成細(xì)胞毒性的“自由基-過氧化物亞硝酸鹽”復(fù)合物，引起自由基介導(dǎo)的神經(jīng)損傷和衰老[30]。本研究中，部分水解香豆膠組小鼠血清中NO和晚期糖基化終末產(chǎn)物水平均顯著下降（表6），這表明部分水解香豆膠可通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)衰老標(biāo)志物含量來抑制衰老。這與Pan Wenjuan等[31]研究發(fā)現(xiàn)金福菇多糖可以降低肝臟組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物的含量進(jìn)而改善小鼠的神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的結(jié)果相一致。正常機(jī)體具有一個(gè)完整的抗氧化酶系統(tǒng)，包括CAT和GSH-Px等，可保持自由基平衡[32]；在衰老狀態(tài)下，機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)受到破壞導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力減弱，過量自由基誘發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷，進(jìn)而促使細(xì)胞甚至器官的損傷[5]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量也是細(xì)胞膜氧化損傷的指標(biāo)，可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度[33]。本研究表明，部分水解香豆膠可以極顯著降低衰老小鼠血清中的MDA含量，而顯著增加CAT和GSH-Px活力（表6）。與Liu Xiaoyan等[17]報(bào)道部分瓜爾豆膠水解物對(duì)衰老小鼠抗氧化影響的研究結(jié)果相比，部分水解香豆膠具有更好的抗氧化作用。研究認(rèn)為，魔芋來源的甘露寡糖能夠維持機(jī)體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，提高免疫性能，從而提高抗氧化能力[34]。海馬體是控制學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要區(qū)域。與其他器官相比，大腦對(duì)氧化損傷更為敏感，氧化損傷可能導(dǎo)致海馬神經(jīng)元變性、DNA損傷和大腦衰老[35]。BDNF信號(hào)通路的激活可促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡[36]。本研究表明，部分水解香豆膠干預(yù)顯著增加衰老小鼠海馬CA1區(qū)BDNF的表達(dá)水平，降低其神經(jīng)元的損傷（圖3）。這些作用可能是通過部分水解香豆膠增強(qiáng)其抗氧化酶活性，減少氧化損傷來介導(dǎo)的。

研究表明，氧化損傷的產(chǎn)生激活了p53/p21/p16信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和衰老[37]。本研究中，部分水解香豆膠顯著提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化能力，降低體內(nèi)氧化損傷。為了進(jìn)一步明確部分水解香豆膠抑制衰老的潛在機(jī)制，繼續(xù)探討了部分水解香豆膠對(duì)p53/p21/p16信號(hào)通路中p53、p21、p16基因和p53、p16蛋白表達(dá)的影響。衰老會(huì)引起p53、p21或p16信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶來干擾細(xì)胞周期進(jìn)程[38]，并誘導(dǎo)腫瘤抑制功能以及與衰老相關(guān)基因的表達(dá)[39]。p53、p21和p16蛋白的過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞衰老[40]。本研究證明了部分水解香豆膠可顯著抑制衰老誘發(fā)的p53/p21/p16信號(hào)通路中相關(guān)基因和蛋白的過度表達(dá)（圖4）。p53蛋白受到刺激后迅速激活p21基因阻止細(xì)胞周期進(jìn)程；p21蛋白間接激活p16基因的表達(dá)，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡和DNA修復(fù)[41]。這表明部分水解香豆膠對(duì)小鼠體內(nèi)p53/p21/p16信號(hào)通路的抑制降低了衰老誘發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量。因此，部分水解香豆膠延緩衰老的機(jī)制可能是其通過提高抗氧化能力而抑制了衰老小鼠p53/p21/p16信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)腦內(nèi)具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用因子的表達(dá)和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到延緩機(jī)體衰老的效果。

4 結(jié) 論

本研究在行為表現(xiàn)、血清代謝及抗氧化水平、神經(jīng)元損傷和相關(guān)衰老基因和蛋白表達(dá)水平等方面對(duì)部分水解香豆膠延長(zhǎng)小鼠壽命的潛在機(jī)制進(jìn)行了初步探究。結(jié)果表明，部分水解香豆膠延緩了小鼠的衰老進(jìn)程，可能與其能夠降低衰老小鼠體內(nèi)乳酸和NO的釋放、增強(qiáng)端粒酶活性和抗氧化能力、修復(fù)組織病理學(xué)損傷、提高腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)、抑制p53/p21/p16信號(hào)通路基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)。部分水解香豆膠有望作為膳食補(bǔ)充劑的配料，發(fā)揮抗衰老的功能活性。