清肺解毒丸的提取工藝研究

康紹建 王飄 朱志坤 郭媛媛 陳凌云

【摘 要】 目的：通過正交試驗優(yōu)選清肺解毒丸的提取工藝。方法：建立梔子苷的HPLC測定方法，通過正交實驗確定最佳提取工藝。結(jié)果：清肺解毒丸的提取工藝為皂角刺、梔子等十一味加水煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮1.5h。結(jié)論：優(yōu)選出的清肺解毒丸提取工藝穩(wěn)定、合理可行，為清肺解毒丸的合理開發(fā)提供參考。

【關(guān)鍵詞】 提取工藝;梔子苷;正交設(shè)計;清肺解毒丸

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）13-0039-04

Study on the Extraction Process of Qingfei Jiedu Pills

KANG Shaojian1，2 WANG Piao1，3 ZHU Zhikun1，3 GUO Yuanyuan1，3 CHEN Lingyun1，3*

1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500，China;2.Yunnan Food and Drug Inspection Center，Kunming 650011，China;3. Yunnan Provincial Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology Research.Kunming 650011，China

Abstract：Objective To optimize the extraction process of Qingfei Jiedu Pills.Methods A HPLC method was established to determination the content of geniposide， and the optimal extraction process was determined by orthogonal test.Results The extraction process was determined by orthogonal test. Results the extraction process of Qingfei Jiedu pill was as follows： 11 kinds of flavors， such as Gleditsia sinensis， garden seed， etc， were decocted with water for 3 times， 10 times of water was added each time， and decocted for 1.5 hours.Conclusion The optimized extraction process of Qingfei Jiedu Pills is stable， reasonable and feasible， and provides a reference for the rational development of Qingfei Jiedu Pills.

Key words：Preparation Process; Geniposide; Orthogonal Design;Qingfei Jiedu Pills

清肺解毒丸由金銀花、梔子、皂角刺等十七味中藥組成，該方具有清熱解毒、燥濕散結(jié)之功效。適用于肺胃濕熱所致的痤瘡、粉刺，癥見顏面、胸背部丘疹樣改變，或有膿皰、癢痛，伴有口渴、小便赤黃、便秘、舌紅苔黃膩等癥。方中君藥金銀花主要含有黃酮類化合物，具有抗炎和解熱之功效[1];梔子含有環(huán)烯醚萜類、有機酸、黃酮、香豆素等成分，現(xiàn)代藥理研究[2]表明梔子具有抗炎、抗氧化、利膽、利尿、抗腫瘤、解熱、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性;皂角刺中含有黃酮、酚類、三萜等成分[3]，常用于治療癰疽腫毒;白芷主要有效成分是香豆素類和揮發(fā)油，具有抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛、止咳平喘等作用[4];該方原為湯劑，烏梢蛇打粉沖服，處方中金銀花、烏梢蛇、蒼術(shù)等所含有效成分熱不穩(wěn)定或水溶性差，難以煎出和保留，因此擬將其開發(fā)成濃縮丸，使患者服用、攜帶方便。本文就制備工藝中的提取工藝進行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;Diamonsil C18色譜柱[迪馬科技（天津）有限公司，4.6mm×250mm，5μm];SK2200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）;T-1000型電子天平（美國雙杰兄弟有限公司）;真空干燥箱（蘇州江東 DZF-6020）。

1.2 試藥 梔子苷對照品（批號：110749-201919，純度97.6%）購至中國食品藥品檢定研究院。皂角刺、梔子等所用飲片均由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)四川千方中藥股份有限公司鑒定與檢驗合格。水為娃哈哈純凈水，色譜甲醇（德國Merck公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 因素水平的確定 實驗在預(yù)實驗以及查閱文獻的基礎(chǔ)上，選擇加水倍數(shù)（A）、提取時間（B）和提取次數(shù)（C）3個因素，各因素取3個水平，以L9（34）正交試驗表安排實驗，以干膏得率和梔子苷轉(zhuǎn)移率綜合評分為指標進行考察，并對其進行方差分析，考察各因素對實驗的影響程度大小，最終確定各參數(shù)的水平，篩選出最佳提取工藝條件[5]。因素水平表見表1。

2.2 干膏得率 稱取1/8倍處方量的飲片共23g，置于圓底燒瓶中，按表1正交試驗表進行回流提取，濾液轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，精密移取50mL至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，取出，置干燥器中冷卻0.5h后迅速稱定其質(zhì)量，計算干膏得率（干膏得率=干浸膏量×20/生藥量）[6]。

2.3 梔子苷轉(zhuǎn)移率[7]

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）為色譜柱;乙腈-水（8∶92）為流動相;檢測波長238nm;進樣體積10μL;流速1mL/min;柱溫25℃;理論塔板數(shù)按梔子苷峰計算應(yīng)不低于2000。

2.3.2 對照品溶液制備 取梔子苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為248.8μg·mL-1的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 稱取1/8倍處方量的飲片共23g，進行回流提取，濾過，合并提取液，加蒸餾水定容至1000mL，搖勻，精密移取20mL，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20mL，合并正丁醇層，水浴揮至近干，殘渣加甲醇溶解，定容至5mL，即得。

2.3.4 陰性對照溶液制備 按照處方比例稱取除梔子以外的其余飲片，同供試品溶液制備方法制得缺梔子的陰性對照溶液。

2.3.5 專屬性考察 取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，如圖1，結(jié)果表明專屬性良好。

2.3.6 線性與范圍 分別精密移取對照品溶液1、2、4、6、8、10mL，至10mL容量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列梯度濃度的溶液，按上述色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標，梔子苷濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=12.532X-11.536（r=0.9998），結(jié)果表明梔子苷對照品含量在24.88～248.8μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.7 儀器精密度 取對照品溶液，重復(fù)進樣6次，結(jié)果梔子苷峰面積的RSD值為0.95%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性 從同一份提取液中，取6份樣品，每份20mL，分別制成供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，計算梔子苷含量的RSD值為1.01%（n=6），結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性 取上述供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣，梔子苷峰面積的RSD值為1.58%（n=6），結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10 準確度 精密量取已知含量的提取液（91.25μg·mL-1）6份，每份5mL，分別加入1.5mL已知濃度的梔子苷對照品溶液（248.8μg·mL-1），按供試品溶液制備方法進行制備，進樣，計算梔子苷含量和回收率。梔子苷的平均回收率為98.71%，RSD為2.53%，結(jié)果表明該方法準確度良好。

2.3.11 飲片含量測定 取梔子飲片3份，按《中國藥典》2020年版一部梔子“含量測定”項下方法分別進行測定，計算含量，結(jié)果得梔子苷平均含量為2.16%，符合藥典標準。

2.4 正交試驗安排與結(jié)果 按表1所設(shè)計因素水平表和表2正交表，依次進行提取，測定各試驗的干膏得率、梔子苷轉(zhuǎn)移率。正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

綜合評分[8]：梔子苷轉(zhuǎn)移率及干膏得率權(quán)重系數(shù)分別為70%和30%，以得出的綜合評分作為指標。綜合評分=（梔子苷轉(zhuǎn)移率/梔子苷最大轉(zhuǎn)移率×0.7+干膏得率/干膏得率最大值×0.3）×100。

根據(jù)表2正交試驗結(jié)果和表3綜合評分方差分析結(jié)果可知，加水倍數(shù)（A）和提取次數(shù)（C）對綜合評分的影響具有顯著性意義，3個因素影響從大到小排序為提取次數(shù)、加水倍數(shù)、提取時間，按綜合評分表中最高值優(yōu)選出最佳提取工藝為A2B2C3，即煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮1.5h。

2.5 工藝驗證 為保證工藝的合理可行，對優(yōu)選出的提取工藝進行驗證。取處方量飲片3份，按A2B2C3條件提取，分別測定其干膏得率及梔子苷轉(zhuǎn)移率，驗證試驗結(jié)果見表4。結(jié)果顯示干膏得率和梔子苷轉(zhuǎn)移率平均值均接近正交試驗中最佳提取工藝結(jié)果，表明此方法具重現(xiàn)性，可作為最佳提取工藝條件。

3 討論

清熱解毒方由金銀花、梔子、皂角刺等十七味藥組成，該方原為湯劑，烏梢蛇打粉沖服，其余藥味以水煎煮。為使患者服用、攜帶方便，本研究擬開發(fā)其新劑型，若改為液體制劑或顆粒劑，烏梢蛇有效成分難以煎出，且烏梢蛇氣腥，煎煮難以掩蓋其氣味，若制成片劑或硬膠囊，因處方量較大，則每次服用片數(shù)或粒數(shù)過多，因此選擇將其開發(fā)為丸劑（濃縮丸），水溶性差和熱不穩(wěn)定成分可打粉入藥，含有水溶性成分的藥采用水提，能較好保留原料藥有效成分，更好發(fā)揮藥效，濃縮丸表面打光還可掩蓋烏梢蛇的特殊氣味，便于服用。

經(jīng)查閱文獻可知，本方中金銀花、烏梢蛇、白芷、浙貝母、蒼術(shù)、連翹中含有游離黃酮類、萜類、苯丙素類、香豆素類、生物堿類等難溶于水的成分[1-4，8-10]，因此以上六味采用打粉入藥。其余皂角刺、紫花地丁等適宜煎煮的飲片采用水提，能較好保留原料藥有效成分，更好發(fā)揮藥效。方中君藥皂角刺含有黃酮類、酚類、三萜類、香豆素類等成分[3]。在2020版中國藥典中，未記載其含量測定方法;紫花地丁主要有效成分是秦皮乙素，含量測定的相關(guān)文獻報道并不多;梔子的主要成分為梔子苷，是環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，易溶于水，受其他成分干擾小，易于測定，故選用梔子苷轉(zhuǎn)移率作為指標來考察提取工藝。

此次試驗利用HPLC法對梔子苷進行測定，從HPLC圖可看出，梔子苷的分離度高，無雜質(zhì)峰干擾，專屬性強，該條件下測定結(jié)果的準確性、精密度、重復(fù)性較為良好，可作為其理想測定方法，為以梔子苷含量為指標的測定方法提供了參考依據(jù)。

正交試驗具有科學(xué)性高、步驟簡單、節(jié)省時間等優(yōu)點，在中藥提取工藝優(yōu)化設(shè)計中被廣泛應(yīng)用[11]，本實驗采用多指標信息熵權(quán)重分析法，結(jié)合正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝，以加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)作為考察因素，以干膏得率和梔子苷轉(zhuǎn)移率為指標。根據(jù)試驗結(jié)果表明，提取次數(shù)對綜合評分影響最大，其次是加水倍數(shù)、提取時間。綜合干膏得率和梔子苷轉(zhuǎn)移率評價指標，得出其最佳提取工藝為煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮1.5h。

參考文獻

[1]

宋亞玲，倪付勇，趙祎武，等.金銀花化學(xué)成分研究進展[J].中草藥，2014，45（539）：158-166.

[2]孟祥樂，李紅偉，李顏，等.梔子化學(xué)成分及其藥理作用研究進展[J].中國新藥雜志，2011，20（11）：26-34.

[3]楊曉峪，李振麟，濮社班，等.皂角刺化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].中國野生植物資源，2015，34（162）：44-47.

[4]朱藝欣，李寶莉，馬宏勝，等.白芷的有效成分提取、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，11（31）：159-166.

[5]陳坤，余曉玲，陳凌云.參威骨痹顆粒的提取工藝研究[J].西北藥學(xué)雜志，2018，33（3）：323-327.

[6]陳坤，陳凌云，王華寧.復(fù)方扶正養(yǎng)肝顆粒的制備工藝研究[J].西北藥學(xué)雜志，2019，34（3）：103-108.

[7]劉承清，趙應(yīng)紅，李曉幸.傣藥芽三英接骨膏提取工藝研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2018，39（304）：69-71.

[8]夏繼成.常用中藥浙貝母的研究進展[J].黑龍江科技信息，2012：52.

[9]胡靜，馬琳，張堅，等.連翹的研究進展[J].中南藥學(xué)，2012， 10（81）：48-52.

[10]陳炎明，陳靜，侴桂新.蒼術(shù)化學(xué)成分和藥理活性研究進展[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，20（4）：101-104.

[11]郭澄，張純，林厚文，等.正交試驗在中藥制劑研究中應(yīng)用[J].時珍國醫(yī)國藥，2000，11（4）：360-362.

（收稿日期：2021-11-04 編輯：劉 斌）