王利娟

摘要：試驗選擇發(fā)熱、貧血、黃疸癥狀明顯的山羊，通過鮮血壓片、血液涂片染色鏡檢和電鏡觀察等方法對山羊附紅細(xì)胞體形態(tài)學(xué)、運動學(xué)和染色特性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，鮮血壓片后光鏡下觀察，山羊附紅細(xì)胞體向任意方向作翻轉(zhuǎn)、扭轉(zhuǎn)運動。姬姆薩氏染色和瑞氏染色后光鏡下觀察，紅細(xì)胞分別被染成藍(lán)色和粉紅色，附著在紅細(xì)胞上的山羊附紅細(xì)胞體都被染成紫紅色，且具有折光性;改良瑞氏染色后光鏡下觀察，紅細(xì)胞被染成深紫色，山羊附紅細(xì)胞體被染成紫紅色;吖啶橙染色后光鏡下觀察，紅細(xì)胞被染成暗綠色，山羊附紅細(xì)胞體被染成發(fā)明亮熒光的綠色小體。

關(guān)鍵詞：山羊附紅細(xì)胞體;病原學(xué);治療;體外殺滅

中圖分類號：S858.27文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.004

Study on Some Biological Characteristics of Eperythrozoon Goat

WANG Lijuan

（Shandong Weifang Hanting District Animal Husbandry Development Center，Weifang Shandong 261100，China）

Abstract：In this experiment，goats with obvious symptoms of fever，anemia and jaundice were selected，the morphological，kinematic and staining characteristics of goat eperythrozoon were studied by means of microscopic examination and electron microscopy. The results showed that the goat eperythrozoon was turning and twisting in any direction. After GIEMSA's staining and Wright's staining，the red blood cells were dyed blue and pink respectively，and the eperythrozoon attached to the red blood cells were dyed purple-red with refraction The red blood cells were dyed deep purple and the goat eperythrozoon was dyed purplish red under the light microscope after the improved Wright's staining，and the red blood cells were dyed dark green under the light microscope after the acridine orange staining，the goat eperythrozoon is dyed into a bright fluorescent green body.

Keywords：goat eperythrozoon，etiology，treatment，in vitro killing

0引言

附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體引起的動物的一種熱性、溶血性的疾病。常呈隱性感染，臨床特征一般表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、腹瀉、消瘦和黃疸。該病易與弓形體等疾病一并發(fā)生，給診斷帶來較大的困難，有必要對附紅細(xì)胞體的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，建立一套實用的從山羊附紅體病原特性著手的診斷方法。

1材料

1.1試驗試劑

肝素鈉、碘、姬姆氏色素、瑞氏色素、吖啶橙、氯化鈣。

1.2試驗儀器

生物顯微鏡、高速臺式離心機(jī)、離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、普通冰箱、分析天平、蒸汽滅菌器、型超聲波清洗器、熒光顯微鏡。

1.3溶劑

0.067 mol/L pH值為6.0的PBS液（磷酸鹽緩沖液）：取23.87 g Na₂HPO₄加純化水至1 000 mL 為a液（0.067mol/L Na₂HPO₄）;取10.40 g NaH₂PO₄加純化水至1 000 mL為b液（0.067 mol/L NaH₂PO₄）。取a液70 mL ，加b 液430 mL，用pH計測其pH值。pH值<6.0加a液校正，pH 值>6.0則加b液校正，滴定至pH值為6.0。

0.01 mol/L pH值為7.2的PBS液：稱取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.1 g Na₂HPO₄、0.2 g KH₂PO₄，加純化水溶解并定容至1 000 mL，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)整pH值為7.2。高壓滅菌后4 ℃保存。

0.1%肝素鈉：稱取0.1 g肝素鈉，加0.01 mol/L pH值為7.2的PBS液至100 mL即可。

0.1%碘溶液：稱取1.0 g I₂，2.0 g KI。先加少量純化水使I₂完全溶解，再用純化水定容至1 000 mL，高壓滅菌后備用。

0.1 mol/L CaCl₂溶液：稱取CaCl2 11.1 g，加純化水溶解并定容至1 000 mL，高壓滅菌后備用。

姬姆薩染色液：分別取姬姆薩氏粉0.5 g、甘油2.5 mL、甲醇2.5 mL。把姬姆薩氏粉放入乳缽，研溶在少量甘油中，再把全部甘油加進(jìn)去，倒入燒瓶內(nèi)，放在60 ℃水浴鍋中水浴2 h，并不斷搖晃攪拌，使其完全溶解，再加入甲醇后混勻過濾，放置2～3周后再過濾1次。臨用時取原液加入去離子水中作10倍稀釋。

瑞氏染色液：分別取瑞氏染劑粉0.2 g，甲醇97 mL，甘油3 mL。將瑞氏染劑粉加入甘油中充分研磨，然后倒進(jìn)去少量甲醇，研磨后傾倒入瓶內(nèi)，再分多次用甲醇沖洗研缽中的甘油溶液，倒入瓶內(nèi)。搖勻，24 h后過濾待用，一般1～2周后再過濾。

改良瑞氏染色液：取瑞氏染色粉0.6 g，姬姆薩氏染色粉1 g，一起放進(jìn)研缽內(nèi)，再加入甘油10 mL充分研磨，然后傾入有色瓶中，加甲醇500 mL混勻，可立即使用。

0.01%吖啶橙PBS液：取0.1 g吖啶橙溶于100 mL 純化水中，置4 ℃冰箱保存，配成原液，取其1份，加0.067 mol/L pH值為6.0的PBS液9份配制，置4 ℃冰箱保存。

2方法

2.1運動學(xué)試驗

2.1.1 血液懸滴鏡檢

頸靜脈無菌采集感染山羊血液，肝素鈉抗凝，滴1 滴于載玻片上，加2～3倍生理鹽水稀釋以降低血液濃度，輕輕蓋上蓋玻片，在油鏡下觀察山羊附紅體的形態(tài)特征及其活動狀況。

2.1.2稀鹽酸作用試驗

取感染山羊抗凝血1滴放在載玻片上，再加1滴0.1% 稀鹽酸溶解紅細(xì)胞，于油鏡下觀察山羊附紅體的運動狀態(tài)。

2.1.3氫氧化鈉作用試驗

取感染山羊抗凝血1滴于載玻片上，再加1滴2.0%氫氧化鈉溶液，作用5 s后，用蓋玻片覆蓋，油鏡下觀察山羊附紅體的運動狀態(tài)。

2.1.4碘制動試驗

用生理鹽水洗滌抗凝血，放在離心機(jī)上以1 500 r/ mm的轉(zhuǎn)速離心15 min，除去上清液和中間的白細(xì)胞層，再把剩下的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，然后加入少許生理鹽水置65 ℃水浴鍋中脫離2 min，3 000 r/min離心10 mm，取上清液置于顯微鏡下，滴上1滴0.1%碘液，肉眼觀察山羊附紅體的運動情況。

2.2染色特性試驗

2.2.1姬姆薩氏染色

制作血涂片，涂片先自然晾干，然后用甲醇固定2～3 min，接著再加入姬姆薩染液染色15～30 min，最后水洗，放室溫干燥后顯微鏡下檢查。

2.2.2瑞氏染色

取潔凈的載玻片，在其右端1/3處蘸血1滴，制成血涂片，干后加瑞氏染液染色1 mm，再加相同量的0.01mol/L PBS液（pH值為6.4）混合均勻，染色3～5 min，最后再水洗，放室溫下干燥后顯微鏡下檢查。

2.2.3瑞氏-姬姆薩混合染色

制作血涂片，把血涂片自然晾干后用瑞氏液將涂膜面均勻覆蓋，稍等一會兒后再加入姬姆薩液，使得膜表面上的染色液形成表面張力，再加終止染色液，染色30～40 min，用水沖洗3 min，晾干后顯微鏡下檢查。

2.2.4吖啶橙（Acridine Orange，AO）染色

血液涂片自然干燥，用甲醇固定10 mm，待其干燥后用0.067 mol/L pH值為6.0的PBS液滴洗，使之濕潤，然后用0.01%吖啶橙PBS滴加到涂片上浸染3 mm，用0.1 mol/L CaCl₂滴片分色45 s，傾去液體，用0.067 mol/L PBS液滴洗后加蓋玻片，在熒光顯微鏡下用吸收波長405 nm，發(fā)射波長600 nm觀察山羊附紅體染色特性，并做陰性對照。

3結(jié)果與分析

3.1運動學(xué)試驗結(jié)果

3.1.1血液懸滴鏡檢結(jié)果

山羊附紅體在血液壓片中可呈現(xiàn)多形性，有點狀、圓形、桿狀、月牙形、球狀、星狀、亞鈴狀等，大小一般為0.3～0.8 μm，在血漿中可做旋轉(zhuǎn)、伸展、前后等運動，附在紅細(xì)胞表面會停止運動，會使得紅細(xì)胞發(fā)生振動。油鏡下觀察，形狀好似空泡。紅細(xì)胞失去原有的雙凹形和表面光滑的形態(tài)特點，呈現(xiàn)不同的形狀，隨著感染率的增高，紅細(xì)胞由近似圓形變成齒輪狀、菠蘿狀、桑椹狀和星芒狀。

3.1.2稀鹽酸作用試驗

滴加1滴0.1%稀鹽酸后，游離的山羊附紅體增多，而且山羊附紅體不受到紅細(xì)胞溶解產(chǎn)生的影響，活性越發(fā)表現(xiàn)增強(qiáng)，并出現(xiàn)左右擺動、迅速旋轉(zhuǎn)、扭轉(zhuǎn)、顫動、上下沉浮等不規(guī)則運動。

3.1.3氫氧化鈉作用試驗

滴加1滴2.0%氫氧化鈉后，油鏡下觀察到，山羊附紅體部分溶解，山羊附紅體開始表現(xiàn)出如滴加稀鹽酸一樣的特點，活動性增強(qiáng)，然后逐漸減弱，直至停止運動。

3.1.4碘制動試驗

在油鏡下可觀察到大量的山羊附紅體做擺動、旋轉(zhuǎn)、上下沉浮等運動，滴加0.1%碘液后，山羊附紅體在活染的過程中逐漸停止運動，不被碘著色。如再用生理鹽水洗滌后，山羊附紅體的活力也不再恢復(fù)。

3.2染色特性試驗結(jié)果

3.2.1姬姆薩氏染色鏡檢結(jié)果

紅細(xì)胞呈藍(lán)色，感染山羊附紅體的紅細(xì)胞邊緣不整齊，呈鋸齒形、多邊形或星芒狀，同時存在一些紅細(xì)胞的碎片;山羊附紅細(xì)胞體表現(xiàn)為紫紅色，可單個附著在紅細(xì)胞上，也可多個附著在紅細(xì)胞上，形態(tài)不太一樣，有的呈月牙形、圓形、短棒狀，也有的呈環(huán)形、逗點狀等。調(diào)節(jié)微調(diào)，可見山羊附紅體折光性強(qiáng)，外周有一白環(huán)，形似氣泡。

3.2.2瑞氏染色鏡檢結(jié)果

瑞氏染色后在油鏡下觀察，紅細(xì)胞呈粉紅色，山羊附紅體呈紫紅色，大多數(shù)山羊附紅體近似圓形。調(diào)節(jié)微調(diào)，可見山羊附紅體折光性強(qiáng)，外周有一白環(huán)，形似氣泡。

3.2.3改良瑞氏染色鏡檢結(jié)果

改良瑞氏染色后在油鏡下觀察，紅細(xì)胞被染成深紫色，山羊附紅體被染成紫紅色。

3.2.4吖啶橙染色鏡檢結(jié)果

在熒光顯微鏡下觀察，紅細(xì)胞呈現(xiàn)為暗綠色，山羊附紅細(xì)胞體表現(xiàn)為發(fā)明亮熒光的綠色小體。在大多數(shù)紅細(xì)胞邊緣以及表面上會看到一些明亮的小體，其大小與姬姆薩染色所觀察到的相近，為被吖啶橙染色的山羊附紅體，而吖啶橙染色的陰性對照組，紅細(xì)胞形態(tài)比較完整，邊緣并沒有發(fā)綠色熒光的小體。

4討論

4.1山羊附紅體的運動學(xué)特性

附紅體是一種寄生在紅細(xì)胞表面或者分散在血漿中的病原體。崔君兆等[1]在高熱的病人和病畜血液內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種不明微生物，認(rèn)為其具有活潑的運動性，這就給后人了解附紅體病原體帶來了困擾，不利于此病的診斷、治療以及預(yù)防。

本試驗在血液懸滴鏡檢中未發(fā)現(xiàn)這種不明微生物，同國內(nèi)大多數(shù)學(xué)者一樣觀察到附紅體能在血漿中作慢速的升降和進(jìn)退、多方向扭曲、伸屈等運動。一旦附紅體附于紅細(xì)胞后運動停止，當(dāng)紅細(xì)胞上附著的附紅體數(shù)量較多時，有時能看到紅細(xì)胞的輕微晃動，這與任峰[2]學(xué)者報道一致：附紅體分為2類，一類在血漿中存在，個體較小，有運動性，稱為球狀附紅體;一類附著在紅細(xì)胞上，個體較大，無運動性，稱為附紅體。滴加1滴0.1%稀鹽酸后，游離的山羊附紅體增多，而且山羊附紅體不受紅細(xì)胞溶解的影響，活性反而明顯增強(qiáng);滴加1滴2.0%氫氧化鈉后油鏡下觀察到，山羊紅細(xì)胞部分溶解，山羊附紅體開始表現(xiàn)如滴加稀鹽酸一樣活動性增強(qiáng)，然后逐漸減弱，直至停止運動;滴加0.1%碘液后，山羊附紅體在活染的過程中逐漸停止運動，并不被碘著色，如再用生理鹽水洗滌，山羊附紅體的活力也不再恢復(fù)，這一特性具有鑒別作用。

4.2山羊附紅體的染色特性

臨床上對山羊附紅體病的診斷通常采用的是血液懸滴鏡檢或者血液涂片染色鏡檢的方法，但是容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，從而造成誤診的現(xiàn)象。經(jīng)過反復(fù)多次試驗論證，造成假陽性結(jié)果的原因主要為：一是在采集血樣、制片、染色的過程中，所使用的試劑不合適，操作過程中各種細(xì)節(jié)不夠規(guī)范等人為的因素;二是在高熱病畜的血液中存在小新菌[3]，大小與山羊附紅體相似，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。為了盡量避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，采集血樣時要做到無菌、無污染，采用恰當(dāng)?shù)目鼓齽┛鼓?，例?%肝素鈉，否則造成正常的紅細(xì)胞變形，錯判為山羊附紅體造成的紅細(xì)胞變形;涂片時，血膜厚薄要適宜;染色時，將血片直立在染色缸中染色;油鏡下觀察時，在一張血片的片頭、片中、片尾觀察，嚴(yán)格按照病原的大小、染色特征，在形態(tài)正常的紅細(xì)胞表面上看到山羊附紅體就可以作為病原確診的依據(jù)。

試驗采用的四種染色方法都可以使山羊附紅體著色，但是優(yōu)缺點不一。瑞氏染色法和姬姆薩氏染色法是臨床上診斷山羊附紅體病常用的染色方法，姬姆薩氏染色法的優(yōu)點是著色效果比較好，只是染色的時間較長，不太適用于快速診斷山羊附紅體，而瑞氏染色法的優(yōu)點是比較簡單、快速，缺點是通常會出現(xiàn)一些顆粒，從而影響觀察結(jié)果。改良瑞氏染色法集前兩者優(yōu)點于一身，能夠在同一血涂片中看到各種不同的色彩，效果明顯，建議作為首選的診斷方法向全國進(jìn)行推廣。吖啶橙染色山羊附紅體會出現(xiàn)2種不同熒光，一種橘紅色熒光體，另一種淡綠色。該染色方法比前三者具有更高的敏感性，但是用吖啶橙染色時核仁和核碎片也會發(fā)出熒光，所以血涂片最好是在采樣現(xiàn)場制作比較合適，同時需要做陰性對照，避免出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象?？傊瑢τ谕徊±?，應(yīng)根據(jù)不同需求采取不同染色方法以提高對山羊附紅體病診斷的準(zhǔn)確率。

5結(jié)論

鮮血壓片后光鏡下觀察，山羊附紅體具有運動性和碘制動性，該特性對附紅細(xì)胞體病和其他動物疾病具有鑒別診斷的作用。對同一病例，根據(jù)山羊附紅體的運動學(xué)及在姬姆薩氏和瑞氏染色鏡檢的基礎(chǔ)上，聯(lián)合采用改良瑞氏染色和吖啶橙染色鏡檢能夠提高山羊附紅細(xì)胞體的檢出率，使診斷結(jié)果更加準(zhǔn)確，同時有針對性地用藥，從而取得良好的治療效果。

參考文獻(xiàn)

[1]崔君兆，陸宙光，張麗華，等.在人和動物血液中發(fā)現(xiàn)一種不明微生物[J].獸醫(yī)科技雜志，1982（2）：53-54.

[2]任峰.兩種豬附紅體病的鑒別診斷[J].中國獸醫(yī)科技，1999，5（29）：12.

[3]尚德秋.附紅體病的研究進(jìn)展[J].中華流行病學(xué)雜志，1994，15（4）：234-240.