【摘要】目的 探索口腔鱗狀細胞癌發(fā)生早期淋巴轉移與否的差異基因，并進一步分析其功能，以探索口腔鱗狀細胞癌發(fā)生淋巴轉移的可能機制。方法 從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE176221芯片數(shù)據(jù)，在R軟件中利用Limma數(shù)據(jù)包篩選差異基因，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot數(shù)據(jù)包進行差異基因的GO和KEGG分析，最后在STRING網站構建蛋白互作網絡，在Cytoscape中篩選出關鍵差異基因。結果 通過分析，共篩選出218個差異基因。對差異基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要調控神經元突觸膜的合成和組裝、絡氨酸磷酸化的調控、內皮細胞的發(fā)育等生物過程;細胞組成富集主要包括遠離基底膜的細胞部分、外側細胞膜成分和AMPA谷氨酸受體復合;分子功能富集主要包括生長因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)富集的細胞通路主要包括PI3K-AKT信號通路、胰島素抵抗、TNF信號通路等。篩選出的5個關鍵基因分別是IL6， VEGFA， HSPA1A， NR4A2和UBC。結論 利用生物信息學篩選出口腔鱗狀細胞癌發(fā)生早期淋巴轉移與否的5個關鍵差異基因可能是其發(fā)生早期淋巴轉移的關鍵機制，有望成為其治療的靶點分子，為今后的研究提供新的思路。

【關鍵詞】口腔鱗狀細胞癌;淋巴轉移;GEO數(shù)據(jù)庫;生物信息學

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合基礎-ZK[2021]一般433）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）是一種具有不同分化程度的具有侵襲性的腫瘤，傾向于早期、廣泛的淋巴結轉移，是口腔最常見的惡性腫瘤，約占口腔癌發(fā)病率的90%，且死亡率高，我國OSCC的死亡率約為1.26/10萬。OSCC病灶周圍器官血液供應和淋巴回流豐富，常發(fā)生早期轉移，手術難度高并且復發(fā)可能性高。其中，淋巴結轉移是OSCC轉移的最主要途徑，對手術切除愈合影響最顯著。因此，探索OSCC早期淋巴轉移的可能機制十分必要。

生物信息學是近年來興起的一門新興學科，重點研究基因組學和蛋白組學。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取基因芯片數(shù)據(jù)，篩選出發(fā)生淋巴轉移的OSCC和未發(fā)生淋巴轉移的OSCC間差異基因，并進一步行基因本體論分析和基因組百科全書分析，最后構建蛋白互作網絡，篩選出核心差異基因，從生物信息學角度出發(fā)探索哪些基因與OSCC發(fā)生淋巴轉移密切相關，為后續(xù)探究OSCC早期淋巴轉移的可能機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1原始數(shù)據(jù)來源

本研究使用芯片來源與GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE176221芯片，平臺文件為GPL20795平臺文件。芯片包含9例OSCC數(shù)據(jù)信息，其中5例發(fā)生淋巴轉移，4例未發(fā)生淋巴轉移。

1.2差異基因分析

將未發(fā)生淋巴轉移的芯片數(shù)據(jù)視為對照組，發(fā)生淋巴轉移的芯片視為實驗組，使用R軟件讀取基因芯片數(shù)據(jù)，使用limma數(shù)據(jù)包篩選差異基因，篩選條件為p<0.05，logFC>1，篩選出差異基因后立業(yè)pheatmap數(shù)據(jù)包繪制差異基因熱圖。

1.3GO和KEGG分析

使用R軟件讀取篩選出的差異基因，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot數(shù)據(jù)包進行差異基因的GO和KEGG分析，以p<0.05作為篩選條件篩選出顯著富及結果。

1.4蛋白互作網絡構建

使用蛋白互助網絡在線分析工具STRING構建差異基因蛋白互作網絡，置信度閾值設為0.7。根據(jù)所得的蛋白互作網絡，在Cytoscape中尋找網絡中的關鍵基因。

2 結果

2.1 差異表達基因

在R軟件中利用limma數(shù)據(jù)包篩選差異表達基因，共篩選出218個差異基因，將差異顯著程度排名前50的基因繪制熱圖，其結果見圖1。

2.2 差異基因的GO分析和KEGG分析

在R軟件中，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot數(shù)據(jù)包對218個差異基因進行GO分析和KEGG分析。

2.2.1 差異基因GO分析結果

以p<0.01作為條件篩選差異基因富集的GO條目，共篩選出76條GO條目，其中生物過程富集了62條，主要包括神經元突觸膜的合成和組裝、絡氨酸磷酸化的調控、p38MAPK通路的正向調控、內皮細胞的發(fā)育等;細胞組成富集了4條，包括遠離基底膜的細胞部分、外側細胞膜成分和AMPA谷氨酸受體復合;，分子功能富集了10條，主要包括生長因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等。選擇前5顯著富集的條目并作柱狀圖，見圖2。

2.2.2 差異基因KEGGE分析結果

以p<0.01作為條件篩選差異基因富集的KEGG條目，共篩選出10條KEGG通路，主要包括，PI3K-AKT信號通路、胰島素抵抗、TNF信號通路等，見圖3。

2.3 蛋白互作網絡分析

在STRING在線網站對218個差異基因進行蛋白互作分析，將所得結果導入到Cytoscape軟件中，得到蛋白互作網絡圖（見圖4），并利用Cytoscape軟件中的MCODE插件篩選Hub基因，共得到5個Hub基因（見圖5）。

3 討論

本研究通過挖掘GEO數(shù)據(jù)庫，對比了口腔鱗狀細胞癌發(fā)生淋巴轉移和未發(fā)生淋巴轉移的差異基因，共發(fā)現(xiàn)218個差異基因。進一步對差異基因進行了GO可KEGG分析。最后對差異基因繪制蛋白互相網絡圖，并篩選差異基因的Hub基因，共篩選出5個Hub基因，分別是：IL6， VEGFA， HSPA1A， NR4A2和UBC。

通過基于功能富集分析發(fā)現(xiàn)相較于未發(fā)生淋巴轉移的口腔鱗狀細胞癌，發(fā)生轉移者差異基因的生物過程主要集中在神經元的發(fā)育和內皮細胞的發(fā)育，這與發(fā)生淋巴轉移特性相符;細胞組成主要集中在細胞自身部分，包括遠離基底膜的細胞膜部分、外側細胞膜成分和AMPA谷氨酸受體復合等，分子功能則主要集中在生長因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等，與癌癥發(fā)生淋巴轉移特性相符。這說明本研究篩選的差異基因與口腔鱗癌發(fā)生淋巴轉移密切相關。

本研究篩選出的5個Hub基因均與腫瘤轉移密切相關。白細胞介素6（Interleukin-6， IL-6）是一串分子量為25kDa的糖基化多肽鏈，參與機體的免疫反應、炎癥、造血、胚胎發(fā)育和其他的基礎過程。有研究指出IL-6在大多數(shù)腫瘤中均高表達，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等，且與腫瘤的侵襲性生長和對治療的反應密切相關。在口腔鱗狀細胞癌方面，有研究證實血清IL-6濃度與其預后密切相關，甚至有研究者提出IL-6可作為口腔鱗狀細胞癌治療的靶點分子。血管內皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor a， VEGFA）是血管內皮生長因子家族的一員，是促進腫瘤內血管生長的重要因子，與腫瘤的生長和轉移密切相關。VEGFA在口腔鱗狀細胞癌中高表達，且與其預后密切相關。熱休克蛋白A1A（Head shock protein A1A， HSPA1A）是熱休克蛋白的一員，參與腫瘤的生長、侵襲和癌變。HSPA1A在多種癌癥組織中均有高表達，且有研究證實其高表達和卵巢上皮癌的預后密切相關。HSPA1A在口腔鱗狀細胞癌中也高表達，且能提高鱗狀癌細胞的惡性程度。核受體4A2（Nuclear receotor 4A2， NR4A2）是核受體亞家族成員之一，參與調控細胞周期、凋亡、脂質代謝、炎癥、成血管化和癌變等過程。NR4A2在多數(shù)實體瘤中均有高表達，如胃腺癌、惡性膠質瘤和直腸癌等。泛素蛋白C（Ubiquitin C， UBC）是編碼泛素蛋白的主要基因之一，在蛋白泛素化過程中起著至關重要的作用。UBC介導的泛素化參與細胞增殖、細胞周期和應急反應等。有研究發(fā)現(xiàn)UBC參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如前列腺癌、膀胱癌和胃癌等。上述五個Hub基因在其他腫瘤中均有不同程度的研究，但在口腔鱗狀細胞癌中HSPA1A， NR4A2和UBC所起的作用還不清楚，且上述五個基因在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生淋巴轉移中的作用及機制還需進一步研究。由于此五個基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，因此，本研究的結果可為口腔鱗狀細胞癌的早期淋巴轉移研究提供新的靶點分子研究思路。

本研究通過對數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行生物信息學的分析，篩選出口腔鱗狀細胞癌發(fā)生早期淋巴轉移與未發(fā)生淋巴轉移的差異基因，并進一步對差異基因進行GO和KEGG分析，最后構建PPI網絡，找到5個關鍵基因。雖然篩選的關鍵基因有部分在口腔鱗狀細胞癌中的研究還不多，在其早期淋巴轉移中的作用及機制還不清楚，但這給我們啟示這些基因可能是口腔鱗狀細胞癌發(fā)生早期淋巴轉移的關鍵基因，未來可能是治療的靶點，還需更多的實驗來驗證。

參考文獻

[1]Di Pardo BJ，Bronson NW，Diggs BS，et al. The global burden of esophageal cancer： A disability-adjusted life-year approach[J].World J Surg，2016，40（2）： 395-401.

[2] 張陳平.口腔癌治療規(guī)范的思考[J].中國腫瘤臨床， 2010， 37（16）： 905-907

[3]Hafed L， Farag H， Shaker O， et al. Is human papilloma virus associated with salivary gland neoplasms？ An in situ-hybridization study[J]. Arch Oral Biol， 2012， 57（9）： 1194-1199.

[4]Li S， Sun YL， Gao DW. Role of the nervous system in cancer metastasis[J]. Oncol Lett， 2013， 5（4）： 1101-1111.

[5]Lee BS， Jang JY， Seo CR， et al. Crosstalk between head and neck cancer cells and lymphatic endothelial cells promotes tumor metastasis via CXCL5-CXCR2 signaling[J]. FASEB J， 2021， 35（1）： E1181.

[6]Kong Y， Li YT， Luo YM， et al. circNFIB1 inhibits lymphangiogenesis and lymphatic metastasis via the miR-486-5p/PIK3R1/VEGF-C axis in pancreatic cancer[J]. Mol Cancer， 2020， 19（1）： 82.

[7]Lin W， Jiang L， Chen YL， et al. Vascular endothelial growth factor-D promotes growth， lymphangiogenesis and lymphatic metastasis in gallbladder cancer[J]. Cancer Lett， 2021， 314（2）： 127-136.

[8]Hunter CA， Jones SA. IL-6 as a keystone cytokine in health and disease[J]. Nat Immunol， 2015， 16（5）： 448-457.

[9]Hasegawa H， Mizoguchi I， Chiba Y， et al. Expanding diversity in molecular structures and functions of the IL-6/IL-12 heterodimeric vytokine family[J]. Front Immunol， 2016， 7： 479.

[10]Dethlefsen C， H?jfeldt G， Hojman P. The role of intratumoral and systemic IL-6 in breast cancer. Breast Cancer Res Treat[J]. 2013， 138（3）： 657-664.

[11]Culig Z， Puhr M. Interleukin-6： a multifunctional targetable cyto kine in human prostate cancer[J]. Mol Cell Endocrinol， 2012， 360（1-2）： 52-58.

[12]Miura T， Mitsunaga S， Ikeda M， et al. Characterization of patients with advanced pancreatic cancer and high serum interleukin-6 levels[J]. Pancreas， 2015， 44（5）： 756-763.

[13]Wu CT， Chen MF， Chen WC， et al. The role of IL-6 in the radiation response of prostate cancer. Radiat Oncol[J]. Radiat Oncol， 2013， 8： 159.

[14]Uzdan Uz， Gorken E. Association Between Interleukin-6 and head and neck squamous cell carcinoma： a systematic review[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol， 2021， 14（1）： 50-60.

[15]Claessom-Welsh L， Welsh M. VEGFA and tumour angiogenesis[J]. J Intern Med， 2013， 273（2）： 114-127.

[16]Caroline BRSS， Marcilei ECB， Renata OdS， et al. Elevated VEGFA mRNA levels in oral squamous cell carcinomas and tumor margins： a preliminary study[J]. J Oral Pathol Med， 2016， 45（7）： 481-485.

[17]Peterle GT， Maia LL， Trivilin LO， et al. PAI-1， CAIX， and VEGFA expressions as prognosis markers in oral squamous cell carcinoma[J]. J Oral Pathol Med， 2018， 47（6）： 566-574.

[18]Nowak M， Glowacka E， Kielbik M， et al. Secretion of cytokines and heat shock protein （HspA1A） by ovarian cancer cells depending on the tumor type and stage of disease[J]. Cytokine， 2017， 89： 136-142.

[19]Andrade WPD， Braga LSC， Goncales NG， et al. HSPA1A， HSPA1L and TRAP1 heat shock genes may be associated with prognosis in ovarian epithelial cancer[J]. Oncol Lett， 2020， 19（1）： 359-367.

[20]Ludwig S， Sharma P， Wise P， et al. mRNA and miRNA profiles of exosomes from cultured tumor cells reveal biomarkers specific for HPV16-positive and HPV16-negative head and neck cancer[J]. Int J Mol Sci， 2020， 21（22）： 8570.

[21]Chen Q， Wu K， Qin X， et al. LASP1 promotes proliferation， metastasis， invasion in head and neck squamous cell carcinoma and through direct interaction with HSPA1A[J]. J Cell Mol Med， 2020， 24（2）： 1626-1639.

[22]Misund L， Selvik LKM， Norsett K， et al. NR4A2 is regulated by gastrin and influences cellular responses of gastric adenocarcinoma cells[J]. PloS One， 2013， 8（9）： E76234.

[23]Karki K， Li X， Jin UH， et al. Nuclear receptor 4A2 （NR4A2） is a druggable target for glioblastomas[J]. J Neurooncol， 2020， 146（1）： 25-29.

[24]Zagani R， Hamzaoui N， Cacheux W， et al. Cyclooxygenase-2 inhibitors down-regulate osteopontin and Nr4A2-new therapeutic targets for colorectal cancers[J]. Gastroenterology， 2009， 137（4）： 1358-1366.

[25]Zhang RC， Yang YJ， Huang HJ， et al. UBC mediated by SEPT6 inhibited the progression of prostate cancer[J]. Mediators Inflamm， 2021， 2021： 73939029.

[26]Castaneda， FA， Busquets CXR， Robles JM. Assessing the clinical benefit of UBC rapid in the surveillance and initial diagnosis of bladder cancer[J]. Clin Genitourin Cancer， 2020， 18（3）： 230-235.

[27]Scarpa ES， Tasini F， Crinelli R， et al. The ubiquitin gene expression pattern and sensitivity to UBB and UBC knockdown differentiate primary 23132/87 and metastatic MKN45 gastric cancer cells[J]. Int J Mol Sci， 2020， 21（15）： 5435.

作者簡介：陳河林（1990-），男，土家族，湖北恩施人，主治醫(yī)師，博士，貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，種植牙和修復