王蒙蒙 喬雪 方瓊蓮 付勝男 李欣坪 黃豐 林玉萍

關(guān)鍵詞滇黃芩;總黃酮;極性萃取部位;非酒精性脂肪肝;保肝;氧化應(yīng)激;炎癥因子

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見的慢性肝病，在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，是隱源性肝硬化和慢性肝病的主要病因之一[1 - 2]。NAFLD的全球患病率約為25%，如果不進(jìn)行及時(shí)治療，可能發(fā)展為肝硬化以及肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌，甚至導(dǎo)致死亡[3]。與NAFLD發(fā)展密切相關(guān)的危險(xiǎn)因素包括胰島素抵抗、脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和纖維化等，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂、減輕氧化應(yīng)激和炎癥是中藥治療NAFLD的關(guān)鍵[4]。

滇黃芩為唇形科植物滇黃芩Scutellaria amoena C.H. Wright 的根，又名枯芩、西南黃芩等，主要分布在云南、四川、貴州等地[5-6]。《云南民族藥大辭典》記載，其味苦、性寒，歸肝、肺、胃、膽、大腸經(jīng)，彝醫(yī)常用于治療肝痛、傳染性肝炎、肺咳等疾病[7]。關(guān)于滇黃芩藥理活性的研究報(bào)道較少，目前的研究報(bào)道僅顯示其具有抗氧化[8-9]、抗心律失常[10]、改善四氯化碳（CCl4）所致肝損傷等作用[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，滇黃芩主要以黃酮類成分為主，具有較好的降脂作用[12-13]。本研究擬以高脂飲食誘導(dǎo)建立NAFLD大鼠模型，考察滇黃芩總黃酮不同極性萃取部位對模型大鼠的保肝作用，探究滇黃芩在抗氧化、保肝等方面的藥用價(jià)值，為民族藥滇黃芩資源的充分利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Infinite M200 PRO 型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司），H1850R型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），RM2016 型組織切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司），XB220A 型電子分析天平（瑞士Precisa 公司），NikonECLIPSE C1 型正置顯微鏡、Nikon Digital Sight DS-FI2型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

1.2 主要藥品與試劑

滇黃芩藥材于2017 年采自云南省新平縣，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院普春霞副教授鑒定為唇形科植物滇黃芩S. amoena C. H. Wright 的根?？偰懝檀迹╰otalcholesterol，TC）測定試劑盒（批號20191102）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）測定試劑盒（批號20191203）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測定試劑盒（批號20191130）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）測定試劑盒（批號20191129）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（批號20191202）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒（批號20191129）均購自南京建成生物工程研究所;丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（ 批號120718190301）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號032219190408）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒（批號112618190311）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒（批號20032602R）、IL-6 檢測試劑盒（批號20032603R）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（批號20032607R）均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;黃芩苷對照品（批號110715-201016，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級SD大鼠，共36 只，雄性，6～8 周齡，體質(zhì)量180～200 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）-2016-0002]。購入后，將大鼠飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、相對濕度（45±5）%、12 h 明暗交替的環(huán)境中，喂養(yǎng)期間予其自由攝食和飲水。本實(shí)驗(yàn)通過了云南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的倫理審核（動物倫理學(xué)審查編號為R-06201945）。

2 方法

2.1 滇黃芩總黃酮不同極性萃取部位的制備

取滇黃芩粉末2 kg，加入8 倍量（16 L）95%乙醇，加熱回流提取3 次、每次2.5 h，分別過濾并收集濾液。合并3 次濾液，減壓回收溶劑得到滇黃芩總黃酮提取物（記為SAF，得率為7.76%;經(jīng)高效液相色譜法測定，SAF中總黃酮含量為61.7 μg/mL，主要含黃芩苷、韌黃芩素Ⅱ -7-O-β-D- 吡喃葡萄糖醛酸甲酯、去甲漢黃芩素Ⅱ-7-O-β-D-吡喃糖醛酸甲酯、黃芩素、高車前素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A等成分）。取適量SAF，用水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取3 次，回收溶劑后分別得到滇黃芩總黃酮乙酸乙酯、正丁醇萃取部位浸膏（分別記為SAFA、SAFB，得率分別為46.14%、17.26%）。將上述提取物的浸膏冷凍干燥成粉末，室溫保存，使用時(shí)用生理鹽水溶解。

2.2 造模、分組與給藥

將36 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)挑選6 只作為正常組，給予普通飼料;其余30 只大鼠為造模組，給予高脂飼料。所有大鼠均喂養(yǎng)12 周，然后將造模組大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、非諾貝特組（陽性對照）、SAF組、SAFA組和SAFB組，每組6 只。正常組、模型組大鼠給予生理鹽水（10 mL/kg）;非諾貝特組大鼠給予非諾貝特（20 mg/kg），劑量參考人體給藥劑量設(shè)置;SAF組、SAFA 組和SAFB 組大鼠分別給予相應(yīng)提取物300mg/kg（均以提取物的量計(jì)），劑量參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。每日灌胃1 次，連續(xù)6周。

2.3 樣本取材及處理

末次灌胃后，大鼠禁食不禁水12 h，稱定其體質(zhì)量。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，于腹主動脈取血;將血液于4 ℃靜置30 min 后，以3 000 r/min 低溫離心15 min，分離血清。同時(shí)，冰上取大鼠肝臟組織，觀察肝臟組織的一般外部形態(tài)（包括顏色、大小、厚度）。

2.4 肝臟指數(shù)測定

取“2.3”項(xiàng)下肝組織，以冰生理鹽水清洗干凈后，用濾紙吸干多余水分，稱量肝臟濕質(zhì)量，并計(jì)算肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)（%）=肝臟濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%[14]。

2.5 血清中TC、TG、AST、ALT、HDL-C、LDL-C 水平測定

取“2.3”項(xiàng)下血清，采用生化法檢測各組大鼠血清中TC、TG、AST、ALT、HDL-C、LDL-C 水平，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書方法進(jìn)行。

2.6 肝組織中SOD、GSH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定

取“2.3”項(xiàng)下肝組織，以生理鹽水制備10%組織勻漿，然后將勻漿在4 ℃下以3 500 r/min 離心15 min，吸取上層勻漿液。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測各組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書方法進(jìn)行。

2.7 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取“2.3”項(xiàng)下肝組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片（3 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，方差不齊性時(shí)兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量和肝臟指數(shù)測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量和肝臟指數(shù)均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，僅SAFB組大鼠的體質(zhì)量顯著降低（P<0.05），但所有給藥組大鼠的肝臟濕質(zhì)量和肝臟指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量和肝臟指數(shù)測定結(jié)果見表1。

3.2 大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平均顯著升高（P<0.05），而HDL-C水平顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，除非諾貝特組大鼠血清中HDL-C水平和SAFA組大鼠血清中HDL-C、ALT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），其余各給藥組大鼠上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05）;與SAF 組、SAFA組比較，SAFB 組大鼠血清中TC、TG、AST 水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平測定結(jié)果見表2。

3.3 大鼠肝組織中MDA、GSH-Px、SOD水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA水平顯著升高（P<0.05），而GSH-Px、SOD水平均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中MDA水平顯著降低（P<0.05），而GSH-Px、SOD 水平均顯著升高（P<0.05）;與SAF組和SAFA組比較，SAFB組大鼠肝組織中MDA水平顯著降低（P<0.05），SOD水平顯著升高（P<0.05）。各組大鼠肝組織中MDA、GSH-Px、SOD水平測定結(jié)果見表3。

3.4 大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）;與SAF組比較，SAFA組大鼠肝組織中IL-1β水平顯著升高，SAFB組大鼠肝組織中IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）;與SAFA 組比較，SAFB 組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定結(jié)果見表4。

3.5 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

正常組大鼠肝細(xì)胞呈規(guī)則的放射狀排列，大小均勻，肝組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)均正常。模型組大鼠肝細(xì)胞周圍可見大量的脂肪空泡，多處細(xì)胞核萎縮壞死，有大量炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比較，非諾貝特組大鼠肝細(xì)胞損傷狀況明顯改善，脂肪空泡明顯減少，細(xì)胞核大小正常，炎癥細(xì)胞浸潤明顯改善。滇黃芩總黃酮各極性萃取部位組大鼠肝損傷狀態(tài)均有不同程度改善，脂肪空泡和細(xì)胞壞死現(xiàn)象明顯減少，但仍有少量炎癥細(xì)胞浸潤;其中，以SAFB 組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化的改善更為明顯。各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察顯微圖見圖1。

4 討論

非諾貝特是臨床上常用于治療高脂血癥的藥物，也常作為陽性藥物在NAFLD相關(guān)研究中使用，故本研究選擇非諾貝特作為陽性對照藥物。血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT 水平是反映NAFLD 程度最常用的指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果顯示，以高脂飼料飼養(yǎng)12 周后，模型組大鼠的體質(zhì)量、肝臟指數(shù)均明顯升高，肝組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，且血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT 水平升高，血清中HDL-C 水平降低，提示建模成功。而非諾貝特組和滇黃芩總黃酮各極性萃取部位組大鼠肝臟指數(shù)均顯著降低，肝組織病理形態(tài)學(xué)變化得到一定程度改善，血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT 水平降低，血清中HDL-C 水平升高，并且SAFB 降低模型大鼠血清中TC、TG、AST水平和改善模型大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化的效果比SAF和SAFA更好。

人體內(nèi)氧化與抗氧化是一個(gè)動態(tài)平衡的過程，肝組織中的主要抗氧化酶系（包括SOD、GSH-Px 等）能夠抑制氧化損傷，是氧化應(yīng)激中重要的靶點(diǎn)[16]。MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，也是反映細(xì)胞氧化程度、病變進(jìn)程的重要指標(biāo)[17]。因此，SOD、GSH-Px 活性及MDA含量通常作為反映機(jī)體氧化損傷程度的指標(biāo)。在NAFLD期間，氧化應(yīng)激可能促進(jìn)肝臟脂質(zhì)堆積、浸潤性炎癥進(jìn)展及間質(zhì)纖維化進(jìn)展，因此，減輕活性氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、保持肝臟氧化還原穩(wěn)態(tài)，可能是防治NAFLD的有利策略[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中MDA水平升高，SOD、GSH-Px 水平降低;而非諾貝特組與滇黃芩總黃酮各極性萃取部位組大鼠肝組織中MDA水平降低，SOD、GSH-Px 水平升高;并且，SAFB 降低模型大鼠肝組織中MDA水平和升高SOD 水平的作用較SAF和SAFA更優(yōu)。

氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是NAFLD發(fā)生的重要病理機(jī)制，當(dāng)氧化應(yīng)激水平升高后，會促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)肝損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高;非諾貝特組與滇黃芩總黃酮各極性萃取部位給藥組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平較模型組顯著降低，并且SAFB 組大鼠肝組織中IL-6、TNF-α水平較SAF 組和SAFA組降低得更為明顯。該結(jié)果表明，滇黃芩總黃酮可減輕NAFLD模型大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)，從而緩解NAFLD的病理進(jìn)程，其中以SAFB的效果更好。

綜上所述，滇黃芩總黃酮各極性萃取部位均可通過調(diào)控氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子的分泌發(fā)揮其對NAFLD的改善作用，且以正丁醇萃取部位的效果更好。