葡萄種質(zhì)果實(shí)有機(jī)酸組分及其含量特性

牛生洋，劉崇懷，劉 強(qiáng)，樊秀彩，張 穎，孫 磊，張曉利,,*，姜建福,*

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009）

葡萄是世界上最古老、栽培面積最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的果樹之一，其果實(shí)既可以鮮食，也用于果脯、制汁或釀酒等，具有很高的經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值。近年來關(guān)于葡萄果實(shí)品質(zhì)的研究多集中于顏色、質(zhì)地、大小等果實(shí)外觀品質(zhì)，然而對(duì)葡萄果實(shí)香味、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、口感等內(nèi)在品質(zhì)研究較少。內(nèi)在品質(zhì)是評(píng)價(jià)果實(shí)商品食用價(jià)值的重要因素，包括糖酸組分及含量、香味、質(zhì)地等，尤其是糖酸組分及含量是決定果實(shí)風(fēng)味的重要指標(biāo)。酸度是葡萄品質(zhì)感知的主要驅(qū)動(dòng)因素，直接影響消費(fèi)者的偏好程度。

葡萄中的有機(jī)酸包括蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、富馬酸等。葡萄有機(jī)酸是果實(shí)代謝的主要產(chǎn)物之一，它的分布特征和濃度大小與葡萄果實(shí)加工特性及化學(xué)成分有著密切關(guān)系，有機(jī)酸會(huì)直接影響葡萄產(chǎn)品的口感平衡、化學(xué)穩(wěn)定性和pH值大小。酒石酸不但是果實(shí)中主要的不可發(fā)酵可溶性酸，還是葡萄酒中的主要酸種類，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味、口感和陳釀潛力有重要影響。與酒石酸相比，蘋果酸則較為柔和，酸味爽口，給人以愉快的感覺，但高含量的蘋果酸會(huì)造成葡萄酒中乳酸含量過高，影響葡萄酒品質(zhì)。檸檬酸及草酸雖然在葡萄中含量較低，但對(duì)葡萄果實(shí)風(fēng)味都有重要影響。

有關(guān)葡萄有機(jī)酸組分研究已有報(bào)道，但結(jié)果不盡一致。Lamikanra等研究發(fā)現(xiàn)葡萄漿果中有機(jī)酸主要為酒石酸，約占總酸含量的84%，同時(shí)，還表明在葡萄漿果存在少量的乙酸、蘋果酸、檸檬酸等有機(jī)酸，以及微量的草酸與琥珀酸。Beara等研究發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄中還含有其他種類的酸，如吡咯烷酮羧酸、戊二酸和2-酮戊二酸等。Topalovic等研究發(fā)現(xiàn)葡萄不同發(fā)育時(shí)期，果實(shí)中有機(jī)酸含量也會(huì)發(fā)生變化，通常蘋果酸和酒石酸會(huì)在葡萄果實(shí)中先積累，然后到轉(zhuǎn)色期蘋果酸含量會(huì)急劇下降，酒石酸含量緩慢增加直至不變。酒石酸與蘋果酸比例差異是種質(zhì)特異性的表現(xiàn)，主要由遺傳背景決定。數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法在果品風(fēng)味品質(zhì)研究中已逐步得到應(yīng)用，借助數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法能夠有效揭示指標(biāo)之間的變化趨勢(shì)和定量關(guān)系。目前，潘照等利用多元線性回歸分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）法和聚類分析法等方法，對(duì)鮮食葡萄果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)、體系及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，開發(fā)并建立了鮮食葡萄品質(zhì)的關(guān)鍵數(shù)據(jù)庫(kù)。江雨則利用PCA法和聚類分析方法著重研究部分中國(guó)野生葡萄的果實(shí)品質(zhì)。但前人研究尚未將不同用途、不同種質(zhì)間葡萄果實(shí)有機(jī)酸組分及含量的差異進(jìn)行對(duì)比分析，且樣本容量也相對(duì)較少。因此，本研究以國(guó)家果樹種質(zhì)鄭州葡萄圃保存的302 份葡萄種質(zhì)資源為研究對(duì)象，進(jìn)行葡萄有機(jī)酸組分及含量的相關(guān)研究，對(duì)比不同用途、不同種質(zhì)間葡萄果實(shí)有機(jī)酸組分及含量的差異，了解其有機(jī)酸含量的分布特性，明確國(guó)內(nèi)富含有機(jī)酸組分的葡萄果實(shí)，以期為葡萄種質(zhì)資源的充分利用和評(píng)價(jià)提供一定依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品于2020年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹所國(guó)家果樹種質(zhì)鄭州葡萄圃中采集。參與實(shí)驗(yàn)的葡萄種質(zhì)樣品共302 份（表1），每份種質(zhì)3組重復(fù)。

根據(jù)往年調(diào)查采收期，在葡萄果實(shí)采收期內(nèi)監(jiān)測(cè)果實(shí)可溶性固形物的變化，直至其穩(wěn)定，種子顏色完全變褐，開始進(jìn)行果實(shí)采樣。每份種質(zhì)取100 粒大小均勻、成熟度一致、無病蟲害的葡萄果實(shí)用于指標(biāo)測(cè)定。將葡萄果實(shí)榨汁，經(jīng)10 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液于50 mL離心管中，經(jīng)液氮冷凍后，置于-80 ℃冷藏備用。

表1 實(shí)驗(yàn)使用的葡萄種質(zhì)樣品Table 1 Grape germplasm samples used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀（配有2707自動(dòng)進(jìn)樣器、2414示差折光檢測(cè)器、2998二極管陣列檢測(cè)器） 美國(guó)Waters公司；料理機(jī) 九陽股份有限公司；砂芯過濾裝置 津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)配有限公司；pH-100A酸度計(jì) 上海平軒科學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有機(jī)酸組分及其質(zhì)量濃度的測(cè)定

參照黃艷等的方法進(jìn)行。

1.3.2 可滴定酸的含量和葡萄pH值的測(cè)定

可滴定酸含量的測(cè)定按照GB/T 12293—1990《水果、蔬菜制品 可滴定酸度的測(cè)定》中電位滴定法；pH值采用酸度計(jì)測(cè)定。

1.3.3 樣品酸度值的測(cè)定

酸度值計(jì)算公式如下：

式中：100、125、130、40分別為檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸的酸度值；、、、分別為樣品中檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2014進(jìn)行趨勢(shì)分析，利用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，利用Origin 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、PCA，利用R語言進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄果實(shí)中有機(jī)酸組成與含量特征

圖1 不同葡萄中4種有機(jī)酸組分及其含量分布圖Fig. 1 Contents of four organic acids in different grape samples

從圖1可見，302 份葡萄種質(zhì)的有機(jī)酸組分均以酒石酸為主，占有機(jī)酸含量的54.87%～69.78%；其次為蘋果酸，含量占19.83%～34.68%；檸檬酸含量占4.87%～13.01%；草酸含量最低，僅占0%～6.69%。因此，葡萄屬于酒石酸優(yōu)勢(shì)型水果。

結(jié)果表明，93.8%的葡萄種質(zhì)酒石酸含量高于蘋果酸；5.12%的種質(zhì)蘋果酸含量與檸檬酸相當(dāng)（兩者之差不大于2%），如黑漢葡萄的蘋果酸與檸檬酸含量極為接近，分別占16.67%和16.78%；另有7.37%的種質(zhì)蘋果酸含量高于酒石酸。此外，有些葡萄種質(zhì)的某一項(xiàng)或幾項(xiàng)指標(biāo)極高或極低。例如，酒石酸含量極低（＜30%）的葡萄種質(zhì)有1 份（碧香無核），而含量極高（≥85%）的葡萄種質(zhì)有3 份（Reliance、維金娜斯、高墨）；蘋果酸含量極低（＜10%）的種質(zhì)有4 份（著色香、蓓蕾玫瑰、洛陽馮舉溝桑葉、維金娜斯），極高（≥58%）的樣品僅有1 份（樺葉葡萄老君山）；草酸含量極高（≥5.0%）的葡萄種質(zhì)有5 份（白玉霓、紅伊豆、京可晶、京玉、井州1060）；檸檬酸含量極高（≥40%）的樣品有1 份（河岸葡萄）；可滴定酸含量極高（≥85%）的樣品有信陽毛葡萄和山葡萄N43-3野生葡萄，其中山葡萄N43-3的總酸質(zhì)量濃度最高，為21.23 mg/mL，而安吉文的總酸含量最低。

2.2 不同用途的栽培種葡萄有機(jī)酸組成及其相關(guān)指標(biāo)平均值比較

不同用途的栽培種葡萄有機(jī)酸質(zhì)量濃度存在差異（表2）。釀酒葡萄酒石酸質(zhì)量濃度明顯高于其他用途的葡萄，而鮮食與釀酒葡萄的酒石酸與蘋果酸質(zhì)量濃度的平均比值無顯著差異（＞0.05）。酒石酸的酸性強(qiáng)于蘋果酸，可降低果汁的pH值。這可能導(dǎo)致釀酒葡萄的pH值低于鮮食葡萄與制汁葡萄。

表2 不同用途葡萄的有機(jī)酸組成及指標(biāo)比較Table 2 Compositions of organic acid composition in grapes used for different purposes

2.3 不同葡萄種群的有機(jī)酸組成及相關(guān)指標(biāo)平均值比較

對(duì)比不同種質(zhì)葡萄中有機(jī)酸質(zhì)量濃度發(fā)現(xiàn)，東亞種群葡萄有機(jī)酸質(zhì)量濃度均高于其他種群，尤其是酒石酸質(zhì)量濃度（表3）。種間雜種與北美種群葡萄的酒石酸質(zhì)量濃度不存在顯著差異；種間雜種與歐亞種葡萄的草酸、蘋果酸、檸檬酸質(zhì)量濃度均無顯著差異。東亞種群葡萄的酒石酸與蘋果酸質(zhì)量濃度之比最低，顯著低于其他葡萄種群；而種間雜種葡萄的比值最高。種間、歐亞、東亞和北美種群葡萄的pH值之間均存在顯著差異。歐亞種的pH值最高，東亞種群葡萄的pH值最低。

表3 不同種群葡萄的有機(jī)酸組成及指標(biāo)比較Table 3 Comparison of organic acid composition of different varieties of grapes

2.4 葡萄中有機(jī)酸組分及其相關(guān)指標(biāo)的變異情況、相關(guān)性、PCA和聚類分析

2.4.1 葡萄有機(jī)酸組分及其相關(guān)指標(biāo)的變異情況

從表4可見，樣品間pH值及可滴定酸含量變異系數(shù)相對(duì)較小，表明樣品間pH值、可滴定酸的差異較??；而草酸、蘋果酸和檸檬酸質(zhì)量濃度變異系數(shù)相對(duì)較高，表明樣品間草酸、蘋果酸和檸檬酸質(zhì)量濃度差異大；酒石酸質(zhì)量濃度、總酸質(zhì)量濃度和酸度值的變異程度中等。將各指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)8 項(xiàng)指標(biāo)中除葡萄pH值呈正態(tài)分布外（＞0.05），其余各項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)偏態(tài)分布。

表4 不同葡萄有機(jī)酸組分變異情況Table 4 Variation coefficients of organic acids among different grape samples

2.4.2 葡萄有機(jī)酸質(zhì)量濃度及其相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

表5結(jié)果表明，酒石酸與草酸質(zhì)量濃度無顯著相關(guān)；除pH值與草酸質(zhì)量濃度外，酒石酸質(zhì)量濃度與有機(jī)酸其他指標(biāo)間均呈顯著正相關(guān)?？偹豳|(zhì)量濃度與酒石酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸質(zhì)量濃度、可滴定酸含量、酸度值均呈顯著正相關(guān)。除草酸質(zhì)量濃度外，pH值與有機(jī)酸其余指標(biāo)均呈顯著負(fù)相關(guān)；其中pH值與可滴定酸含量的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值最大，為0.973。酒石酸與蘋果酸質(zhì)量濃度的比值與蘋果酸質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值最大（0.521），其次是酒石酸質(zhì)量濃度（0.396）。同時(shí)，酒石酸與蘋果酸質(zhì)量濃度的比值與pH值等呈顯著負(fù)相關(guān)，而與可滴定酸含量等呈顯著正相關(guān)。

表5 不同葡萄種質(zhì)有機(jī)酸組分及其相關(guān)性Table 5 Correlation among organic acids of different grape varieties

2.4.3 葡萄有機(jī)酸質(zhì)量濃度及其相關(guān)指標(biāo)的PCA

利用有機(jī)酸組分、pH值、可滴定酸含量、酸度值、總酸質(zhì)量濃度等作為不同的維度進(jìn)行PCA，自動(dòng)擬合出3個(gè)PC。由表6可知，前3個(gè)PC的累計(jì)貢獻(xiàn)率已達(dá)到88.80%（＞85%），說明在變量不丟失的前提下，這3個(gè)PC可以包含原始數(shù)據(jù)88.80%的信息，因此可以用這3個(gè)PC代表9個(gè)酸有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。其中酸度值的載荷值在PC1中最大，說明酸度值對(duì)PC1影響較大，因此選擇酸度值代表PC1。在PC2中酒石酸與蘋果酸質(zhì)量濃度的比值的載荷值最大，說明酒石酸與蘋果酸質(zhì)量濃度的比值對(duì)PC2的影響較大，因此選擇酒石酸與蘋果酸質(zhì)量濃度的比值代表PC2。PC3綜合了檸檬酸、草酸質(zhì)量濃度兩個(gè)指標(biāo)，但是草酸質(zhì)量濃度的載荷值大于檸檬酸質(zhì)量濃度的載荷值，因此可用草酸代表PC3。上述分析可得，評(píng)價(jià)葡萄有機(jī)酸品質(zhì)的3個(gè)核心指標(biāo)可為酸度值、酒石酸與蘋果酸質(zhì)量濃度的比值、草酸質(zhì)量濃度。

表6 葡萄果實(shí)有機(jī)酸組分的因子載荷矩陣、方差貢獻(xiàn)率及初始特征值Table 6 Factor loading matrix, variance contribution rate and initial eigenvalues of organic acids in grape berries

PC1與PC2的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了77%以上（表6），表明PC1與PC2兩個(gè)PC可以代表其他指標(biāo)進(jìn)行分析。因此，選取PC1、PC2，在PC1-PC2平面上作不同葡萄種質(zhì)PC散點(diǎn)圖。由圖2可見，東亞種群葡萄、種間雜種、歐亞種群、北美種群葡萄PC之間有著明顯區(qū)別；此外，種間雜種與歐亞種群葡萄主要集中于坐標(biāo)軸左上方附近，且兩者的重疊度較高，這可能是因?yàn)闅W亞種與歐美雜種在親緣關(guān)系上比較近。

圖2 葡萄果實(shí)有機(jī)酸組分PCA散點(diǎn)圖Fig. 2 Scatter plot of PC1 versus PC2 for analysis of organic acids in grape berries

2.4.4 葡萄有機(jī)酸質(zhì)量濃度及其相關(guān)指標(biāo)的聚類分析

圖3 葡萄種質(zhì)有機(jī)酸組分的聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis of organic acids of grape varieties

聚類分析結(jié)果表明，302 份葡萄種質(zhì)一共可以分成四大類（圖3）。其中第1類（紅色）主要由華東葡萄、腺枝葡萄等12 份野生葡萄種質(zhì)聚類在一起。第3類（綠色）由65.87%歐亞種、32.23%歐美雜種、1%的歐山雜種和1%的美洲種組成；其中歐山雜種和美洲種葡萄分別為熊岳白葡萄和公釀1號(hào)、早康可和俄羅斯康可。而第2類（藍(lán)色）則是由16 份歐美雜種、27 份歐亞種、5 份野生種、4 份歐山雜種和3 份美洲種葡萄組成；其中白比諾、佳麗釀、霞多麗等釀酒葡萄在第2類中占到了56.36%，而鮮食與制汁種質(zhì)在其中僅占了43.64%；此外，第2類中的5 份野生種質(zhì)為高山2號(hào)、福安刺葡萄、高山1號(hào)、圓葉葡萄、蘡薁-林縣；其中，福安刺葡萄、高山1號(hào)、高山2號(hào)等野生葡萄多作為釀酒葡萄使用。第4類（紫色）由11 份種間雜種、5 份歐亞種和9 份野生種葡萄組成；其中9 份野生種葡萄包括4 份刺葡萄、3 份桑葉葡萄、1 份華東葡萄、1 份秋葡萄。

3 討 論

果實(shí)有機(jī)酸含量高低直接影響葡萄果實(shí)品質(zhì)，不同葡萄種質(zhì)的有機(jī)酸含量與組分差異較大，篩選低酸高糖的葡萄種質(zhì)，培育風(fēng)味特異的葡萄新種質(zhì)對(duì)葡萄產(chǎn)業(yè)具有重要意義。葡萄有機(jī)酸約占果汁總質(zhì)量的1%，其中酒石酸與蘋果酸為有機(jī)酸的主要成分（約占總酸的90%），其他有機(jī)酸如檸檬酸、草酸和其他酸的含量受環(huán)境條件和品種的影響。

實(shí)驗(yàn)中302 份葡萄種質(zhì)的有機(jī)酸以酒石酸為主（1.54～12.67 mg/mL），其中山葡萄N43-3有機(jī)酸質(zhì)量濃度最高，安吉文質(zhì)量濃度最低；其次是蘋果酸（0.33～9.88 mg/mL），樺葉葡萄老君山的蘋果酸質(zhì)量濃度最高，而Reliance的蘋果酸質(zhì)量濃度最低；檸檬酸和草酸均少量存在于葡萄果實(shí)中。其中檸檬酸與草酸質(zhì)量濃度與前人的檢測(cè)結(jié)果稍有出入，可能與葡萄品種或品系的差異（內(nèi)因）及葡萄生長(zhǎng)環(huán)境（光照、水分、溫度）不同有關(guān)。

栽培種葡萄果實(shí)中有機(jī)酸質(zhì)量濃度由高到低為酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸，符合葡萄果實(shí)中不同有機(jī)酸分布規(guī)律，保證本研究數(shù)據(jù)可靠性。而野生種葡萄中，除刺葡萄株系外，桑葉葡萄、腺枝葡萄、華東葡萄、河岸葡萄等果實(shí)中蘋果酸質(zhì)量濃度均高于酒石酸，是酒石酸質(zhì)量濃度的1.2～1.7 倍，其原因有待進(jìn)一步探討。但從整體而言，栽培種葡萄有機(jī)酸質(zhì)量濃度普遍低于野生種葡萄，這是因?yàn)樵耘嗥贩N葡萄經(jīng)過人為選育，有機(jī)酸質(zhì)量濃度逐漸降低，而野生種葡萄未經(jīng)過人為選育，保留著原始的特性。

目前，葡萄種質(zhì)資源的選育一直是以降酸為目的。但是李紀(jì)明等研究表明高糖高酸的葡萄種質(zhì)更適合釀酒；劉懷峰研究也表明高酒石酸含量會(huì)在一定程度上提高漿果的釀酒品質(zhì)，酒石酸含量較高的品種會(huì)使葡萄酒的顏色、氧化性更加穩(wěn)定，而低酒石酸的葡萄種質(zhì)釀造的葡萄酒酒體平淡、瘦弱，從而產(chǎn)生“泛渾病”。因此，釀酒時(shí)適量增加有機(jī)酸含量，可以使酒體更加豐滿、醇厚。本研究302 份葡萄種質(zhì)中野生種葡萄有機(jī)酸質(zhì)量濃度是栽培種葡萄的2～10 倍，由此可見野生葡萄資源中具有十分豐富的有機(jī)酸資源，是提供可食用有機(jī)酸的途徑之一。我國(guó)是東亞種群葡萄主要分布地，其中刺葡萄、山葡萄、毛葡萄等中國(guó)野生葡萄株系，已經(jīng)應(yīng)用在我國(guó)釀酒工業(yè)上，為我國(guó)的釀酒資源的增加做出貢獻(xiàn)。同時(shí)，高酸低糖特性使山葡萄、毛葡萄等中國(guó)野生葡萄亦可以作為種質(zhì)育種時(shí)父母本，為我國(guó)的育種與資源保護(hù)做出貢獻(xiàn)。

研究者對(duì)多樣品多指標(biāo)的品質(zhì)分析越來越廣泛地應(yīng)用PCA和聚類分析。聚類分析結(jié)果表明，302 份葡萄種質(zhì)可以分成四類：第1類主要是由野生葡萄組成，均為高有機(jī)酸的葡萄種質(zhì)；第2類不僅包括釀酒葡萄，還含有少量刺葡萄種質(zhì)（如高山1號(hào)、高山2號(hào)等），可能是因?yàn)檫@部分刺葡萄種質(zhì)的有機(jī)酸組分與釀酒葡萄較為接近，因此這部分刺葡萄種質(zhì)亦可作為釀酒葡萄資源。本研究通過對(duì)酒石酸、檸檬酸、草酸和蘋果酸共4個(gè)組分的聚類分析發(fā)現(xiàn)，華東葡萄、腺枝葡萄、山葡萄等12 份種質(zhì)為酒石酸、蘋果酸和總有機(jī)酸質(zhì)量濃度較高的特異資源，可作為獲取這些組分的重要種質(zhì)并加以利用。有機(jī)酸是葡萄果實(shí)代謝的主要產(chǎn)物之一，具有豐富的開發(fā)利用潛能。山葡萄、毛葡萄是有機(jī)酸質(zhì)量濃度較高的特異種質(zhì)，可在奮力提取或開發(fā)其功能產(chǎn)品時(shí)作為重要原料。中國(guó)野生葡萄資源十分豐富，國(guó)內(nèi)研究者尚未對(duì)葡萄有機(jī)酸進(jìn)行全面、系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，因而對(duì)葡萄有機(jī)酸進(jìn)行系統(tǒng)全面的評(píng)價(jià)亟待進(jìn)行，以便對(duì)于中國(guó)野生葡萄資源的進(jìn)一步開發(fā)利用。

4 結(jié) 論

302 份葡萄種質(zhì)的有機(jī)酸主要為酒石酸、蘋果酸和檸檬酸，其中山葡萄N43-3總酸質(zhì)量濃度最高（21.23 mg/mL），安吉文的總酸質(zhì)量濃度最低（2.91 mg/mL）。在不同葡萄種群中，東亞種群葡萄的總酸質(zhì)量濃度最高，其次是北美種群，歐亞種群的總酸質(zhì)量濃度最低，而在不同用途葡萄種質(zhì)中，釀酒葡萄的總酸質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于其他兩個(gè)用途的葡萄。