羊棲菜褐藻糖膠寡糖組分分析及抗凝血活性

劉 雪，任晨瑜,2，劉 新，張綿松，白新峰，王令書(shū)，崔婷婷，史亞萍，劉昌衡，賈愛(ài)榮,*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250103；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053）

多糖是近年來(lái)研究較多的一種活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖降血脂等生物活性。但是，多糖作用靶點(diǎn)不明確、分子質(zhì)量大、黏度高、生物利用度低，極大限制了其在醫(yī)藥上的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。近年來(lái)，寡糖的相關(guān)研究逐漸增多，與多糖相比，寡糖結(jié)構(gòu)清晰、水溶性高、生物利用度好，部分寡糖顯示出與母糖相似或高于母糖的生物活性。因此，寡糖的開(kāi)發(fā)研究對(duì)糖類化合物的發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。

褐藻糖膠又名巖藻聚糖硫酸酯，是一種硫酸化多糖，廣泛存在于褐藻和海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中。褐藻糖膠具有明顯的抗凝血活性，Mansour等從海參中分離出高分子質(zhì)量，高硫酸基含量的褐藻糖膠，這種褐藻糖膠表現(xiàn)出主要由肝素輔因子II介導(dǎo)的強(qiáng)抗凝血活性。Wang Jing等從海帶中得到了3種低分子質(zhì)量褐藻糖膠，這3種多糖均能顯著延長(zhǎng)活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，具有較好的抗凝血活性。Li Bo等研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯能夠顯著延長(zhǎng)活化部分凝血酶時(shí)間，具有良好的抗凝血活性。羊棲菜（）是一種常見(jiàn)的褐藻，隸屬于褐藻門(mén)墨角藻目馬尾藻科，具有較高的食用和藥用價(jià)值，廣泛分布于我國(guó)的淺海水域，韓國(guó)、日本也有分布。褐藻糖膠是羊棲菜中重要的活性成分，但是，羊棲菜褐藻糖膠也存在分子質(zhì)量大、黏度高等特點(diǎn)，限制了它的開(kāi)發(fā)利用。寡糖的研究有利于推進(jìn)褐藻糖膠進(jìn)一步的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)從羊棲菜中分離純化得到一種褐藻糖膠，采用酸降解法降解得到5種寡糖組分，通過(guò)測(cè)定活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）評(píng)價(jià)其抗凝血活性。篩選高抗凝血低分子質(zhì)量寡糖組分，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜解析，探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜取自于2018年5月采自浙江省平陽(yáng)縣南麂島國(guó)家海洋自然保護(hù)區(qū)。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Flu-ka公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白和低分子質(zhì)量肝素鈉 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；APTT、TT、PT測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；DEAE-Sepharose Fast Flow 美國(guó)GE healthcare公司；Bio-gel P4（Fine，45 μm） 美國(guó)Bio-Rad公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Elipse XDB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm）、1260高效液相色譜儀、LCMS6460質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；ohpak SB-804HQ高效凝膠滲透色譜柱日本Shodex公司；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；SL-318半自動(dòng)血凝儀 濟(jì)南森藍(lán)公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻糖膠提取和分離純化

羊棲菜褐藻糖膠的提取參照Silchenko等的方法且略作修改。將羊棲菜洗凈烘干，粉碎成末。取適量藻體粉末，加入95%乙醇脫脂，料液比為1∶30（g/mL），室溫下攪拌24 h。取適量脫脂后的藻體粉末，加入2% CaCl溶液，料液比為1∶30（g/mL），60 ℃攪拌3 h，靜置，冷卻到室溫，離心，收集上層清液。將上層清液超濾濃縮，截留分子質(zhì)量為100 kDa。濃縮后的提取液加入4 倍體積95%乙醇溶液，醇沉，4 ℃靜置過(guò)夜12 h，離心，收集沉淀部分。沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇脫水后，置于40 ℃烘箱中干燥，得到羊棲菜多糖粗品。采用DEAESepharose Fast Flow陰離子交換柱（4.0 cm×30 cm）對(duì)羊棲菜多糖進(jìn)行分離純化，0、0.5、1、2、3 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集2 mol/L洗脫組分，除鹽、濃縮凍干，命名為SFF。

1.3.2 HPGPC法測(cè)定分子質(zhì)量

將不同分子質(zhì)量系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)SFF配制成5 mg/mL的溶液，在下述條件下測(cè)定分子質(zhì)量。分析柱：Shodex ohpak SB-804HQ（7.6 mm×300 mm），示差折光檢測(cè)器在線檢測(cè)，流動(dòng)相0.1 mol/L NaSO溶液，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。繪制以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品的分子質(zhì)量。

1.3.3 單糖組成

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定SFF的單糖組成。準(zhǔn)確稱取2 mg樣品，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，110 ℃條件下降解6 h，得到完全酸水解的單糖樣品。對(duì)單糖標(biāo)準(zhǔn)品及完全酸水解的單糖樣品進(jìn)行PMP衍生，首先將其溶于100 μL蒸餾水，加入100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液及120 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，置于70 ℃水浴中反應(yīng)100 min。反應(yīng)完畢后中和，用二氯甲烷萃取3 次，除去未反應(yīng)的PMP，上層液體過(guò)0.22 μm的微孔濾膜后進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件：C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流動(dòng)相為磷酸緩沖溶液-乙腈（83∶17，/），流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

1.3.4 理化性質(zhì)

總糖含量：采用硫酸-苯酚法測(cè)定，蛋白含量：采用Folin-酚法測(cè)定；硫酸基含量：采用氯化鋇明膠比濁法測(cè)定；糖醛酸含量：采用咔唑-硫酸法測(cè)定。

1.3.5 寡糖的制備

將多糖以0.1 mol/L HCl溶液配制成10 mg/mL，于80 ℃水浴10 h，反應(yīng)液降至室溫后，調(diào)節(jié)pH值至中性。透析（截留分子質(zhì)量為100 Da），濃縮凍干，樣品備用。

1.3.6 寡糖的分離純化

降解產(chǎn)物采用Bio-Gel P4色譜柱進(jìn)行分離純化。以0.2 mol/L NHHCO溶液為流動(dòng)相，0.1 mL/min洗脫，洗脫后采用硫酸-苯酚法檢測(cè)，收集峰尖部分，除氨凍干。

1.3.7 寡糖的質(zhì)譜分析

采用負(fù)離子模式下的電噴霧質(zhì)譜對(duì)寡糖進(jìn)行分析。取少量寡糖組分，以乙腈-水（1∶1，/）溶液溶解，使其濃度達(dá)到5～10 pmol/L，注射5 μL進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析中，以氮?dú)庾鳛槿軇┑拇蹈蓺怏w和噴霧氣體，流速分別為250 L/h和15 L/h；流動(dòng)相為乙腈-水（1∶1，/），在泵的動(dòng)力下，從注射器以10 μL/min的流速注入；毛細(xì)管電壓為3 kV，錐孔電壓為50 eV，離子源和溶劑揮發(fā)溫度分別為80 ℃和150 ℃。

1.3.8 核磁共振波譜分析

稱取10 mg寡糖樣品，用重水溶解后凍干，反復(fù)3 次。得到的樣品溶于0.5 mL重水中，加入少量?jī)?nèi)標(biāo)氘代丙酮，采用Bruker Avance III HD 400 MHz核磁共振波譜儀測(cè)定核磁圖譜。

1.3.9 抗凝血活性測(cè)定

將SFF配制成0.5、1.0、2.5 mg/mL，與血漿以1∶9的體積比混合。APTT、TT、PT的測(cè)定按照試劑盒要求進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻糖膠的分離純化、分子質(zhì)量和理化性質(zhì)分析

從羊棲菜中提取得到褐藻糖膠粗品，經(jīng)DEAESepharose Fast Flow陰離子交換柱分離純化，得到3個(gè)明顯的洗脫峰（圖1），收集含量最高的2 mol/L NaCl溶液洗脫組分為SFF。測(cè)定褐藻糖膠SFF的分子質(zhì)量和理化性質(zhì)如表1所示。SFF的分子質(zhì)量較高，為708 kDa；總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.44%；蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，為1.14%；硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.22%，不含糖醛酸。SFF的分子質(zhì)量和理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果與前期報(bào)道的結(jié)果相似。

圖1 褐藻糖膠SFF的分離純化圖Fig. 1 Chromatogram for separation and purification of SFF

表1 褐藻糖膠SFF的理化性質(zhì)分析Table 1 Physicochemical properties of SFF

2.2 褐藻糖膠的單糖組成分析

如圖2所示，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可知，SFF由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖4種糖基組成，物質(zhì)的量比為67.11∶26.69∶2.54∶3.66，其中巖藻糖和半乳糖為主要組成成分。SFF含有大量的硫酸基團(tuán)和巖藻糖，進(jìn)一步表明SFF是褐藻糖膠的一種。

圖2 褐藻糖膠SFF的單糖組成分析Fig. 2 Monosaccharide composition of SFF

2.3 寡糖的分離純化

將多糖降解產(chǎn)物配制成10 mg/mL，經(jīng)Bio-Gel P4色譜柱分離純化，洗脫液以硫酸-苯酚法檢測(cè)糖含量，繪制洗脫曲線，如圖3所示。多糖降解產(chǎn)物分離后，得到5種寡糖組分，根據(jù)分子質(zhì)量大小，命名為P1～P5，其中P1分子質(zhì)量最大。

圖3 褐藻糖膠SFF降解產(chǎn)物的Bio-Gel P4譜圖Fig. 3 Gel permeation chromatogram of oligosaccharides on Bio-Gel P4

2.4 寡糖的抗凝血活性

在凝血機(jī)制中，APTT反映了內(nèi)源性或者共同凝血途徑，TT反映了對(duì)凝血酶活性或者纖維蛋白的作用，PT反映了外源性凝血途徑。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定5種寡糖組分對(duì)APTT、TT、PT的延長(zhǎng)作用，以評(píng)價(jià)寡糖的抗凝血活性。如表2所示，5種寡糖組分均可延長(zhǎng)APTT，其中寡糖組分P1、P2、P3對(duì)APTT的延長(zhǎng)作用高于P4、P5，P3的延長(zhǎng)作用尤其明顯。對(duì)TT和PT無(wú)延長(zhǎng)作用，說(shuō)明羊棲菜褐藻糖膠寡糖組分對(duì)內(nèi)源性或者共同凝血途徑有抑制作用，對(duì)凝血酶活性、纖維蛋白的聚合以及外源性凝血途徑的作用不大。與肝素相比，寡糖組分對(duì)APTT的延長(zhǎng)作用偏低，但是較為溫和，隨著濃度的增加，延長(zhǎng)作用逐漸增加，而肝素在50 μg/mL時(shí)，APTT已達(dá)到200 s。此外，肝素對(duì)PT和TT均具有顯著的延長(zhǎng)作用，而寡糖組分對(duì)PT和TT的延長(zhǎng)作用不明顯，說(shuō)明羊棲菜褐藻膠寡糖與肝素的抗凝機(jī)制不完全相同。目前，有關(guān)褐藻糖膠/褐藻糖膠寡糖的抗凝血活性研究較少，抗凝血寡糖的結(jié)構(gòu)研究更為少見(jiàn)。趙雪等采用自由基氧化降解法制備了不同分子質(zhì)量和硫酸基含量的褐藻糖膠，測(cè)定了抗凝血活性，揭示了褐藻糖膠中影響抗凝血活性的主要因素，但是，對(duì)高抗凝血活性褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)并無(wú)說(shuō)明，且分子質(zhì)量降低后活性明顯降低。Wang Jing等從海帶中分離得到的3種低分子質(zhì)量褐藻糖膠，均能顯著延長(zhǎng)活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，具有較好的抗凝血活性，但是分子質(zhì)量仍較大，為4～8 kDa。

表2 褐藻糖膠SFF寡糖組分的抗凝血活性Table 2 Anticoagulant activity of oligosaccharides derived from SFF

2.5 寡糖組分P3的質(zhì)譜及核磁共振波譜分析

寡糖組分P3是具有高抗凝血活性同時(shí)分子質(zhì)量最小的組分，因此，采用質(zhì)譜法對(duì)P3的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜（圖4）顯示P3主要存在雙電荷離子峰/307，表明P3主要由分子質(zhì)量為616 Da的寡糖片段組成，推斷其為二硫酸化巖藻三糖[Fuc(SO)]。二級(jí)質(zhì)譜給出了/307（圖5）的斷裂片段，但是信息相對(duì)較少。因此，對(duì)寡糖組分P5、P4中的寡糖片段進(jìn)行質(zhì)譜分析，進(jìn)而推斷出二硫酸化巖藻三糖的結(jié)構(gòu)。

圖4 寡糖組分P3的負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 4Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P3

圖5 寡糖片段m/z 307二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 5 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 307

圖6 是寡糖組分P5的一級(jí)質(zhì)譜，離子/243推斷為硫酸化巖藻單糖，是其主要的寡糖片段。二級(jí)質(zhì)譜（圖7）顯示了離子/243斷裂片段信息，碎片離子/139推斷為X斷裂，而X斷裂是C-2硫酸化的主要斷裂方式，推斷硫酸基團(tuán)可能位于C-2位。高豐度碎片離子/97的出現(xiàn)表明硫酸基團(tuán)也可能位于C-3位。因此，硫酸基團(tuán)可能位于巖藻糖的C-2或C-3位。

圖6 寡糖組分P5的負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 6 Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P5

圖7 寡糖片段m/z 243二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 7 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 243

圖8 是寡糖組分P4的一級(jí)質(zhì)譜，離子/389推斷為硫酸化巖藻二糖，是其主要的寡糖片段之一。二級(jí)質(zhì)譜（圖9）顯示了離子/389的碎片離子信息，/329的出現(xiàn)表明二糖間的連接方式為1→4連接，且還原端巖藻糖C-3位上無(wú)硫酸基團(tuán)。未出現(xiàn)碎片離子/139表明還原端巖藻糖的C-2位上無(wú)硫酸基團(tuán)，因此硫酸基團(tuán)位于非還原端的C-2或C-3位。綜上所述，硫酸化巖藻二糖可能存在以下異構(gòu)體：--Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc和-Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc。

圖8 寡糖組分P4的負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 8 Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P4

圖9 寡糖片段m/z 389二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 9 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 389

根據(jù)上述分析結(jié)果可知，SFF寡糖組分的硫酸基團(tuán)位于巖藻糖基的C-2和C-3位，巖藻糖基之間的連接方式為1,4-連接。推斷離子/307為二硫酸化巖藻三糖，因此，它的結(jié)構(gòu)可能是在硫酸化巖藻二糖的基礎(chǔ)上增加硫酸基團(tuán)及巖藻糖殘基。在離子/307的二級(jí)質(zhì)譜中，碎片離子/139的出現(xiàn)表明存在還原端C-2位硫酸基團(tuán)，相對(duì)高豐度碎片離子/97的出現(xiàn)表明硫酸基團(tuán)也可能位于巖藻糖殘基的C-3位，這與前述分析結(jié)果一致。此外，碎片離子/234推斷為二硫酸化巖藻二糖，表明兩個(gè)硫酸基團(tuán)相鄰。因此，離子/307可能存在以下異構(gòu)體，如圖10所示，--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc(2SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc(2SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc(3SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc(3SO)。二硫酸化巖藻三糖中硫酸基團(tuán)的位置還可通過(guò)核磁共振氫譜進(jìn)一步確定。如圖11所示，低場(chǎng)區(qū)5.00～5.50為--Fuc異頭氫所在的區(qū)域，主要有3個(gè)異頭氫信號(hào)5.16、5.26及5.42，1.25是巖藻糖C-6位甲基上的氫信號(hào)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，5.42處為2-硫酸化-巖藻糖殘基，5.26處為3-硫酸化-巖藻糖殘基。其中，5.26處的異頭氫信號(hào)強(qiáng)度最高，說(shuō)明二硫酸化巖藻三糖的硫酸基團(tuán)主要位于C-3位。這與質(zhì)譜分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明了二硫酸化巖藻三糖的硫酸基團(tuán)位于C-2和C-3位，C-3位是主要的硫酸化位點(diǎn)。

硫酸化多糖的生物活性與多種因素有關(guān)，如分子質(zhì)量、硫酸基團(tuán)含量等。Liu Xue等從綠藻中提取得到硫酸化鼠李聚糖，發(fā)現(xiàn)其抗凝血活性隨著分子質(zhì)量的減小逐漸降低。Mazumder等從紅藻中提取得到硫酸化半乳聚糖，其抗病毒活性與分子質(zhì)量密切相關(guān)，分子質(zhì)量越高，對(duì)單純皰疹病毒I和II的選擇性抗病毒活性越明顯。硫酸基團(tuán)含量也是影響多糖生物活性的重要因素，Koyanagi等研究發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠和過(guò)硫酸化褐藻糖膠均可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的有絲分裂和趨化性，但是過(guò)硫酸化褐藻糖膠的抑制作用更加明顯。本實(shí)驗(yàn)中，寡糖組分P3主要是二硫酸化巖藻三糖，P4主要是硫酸化單糖（/243）和硫酸化/二硫酸化二糖（/389、405、485）的混合物，P5主要是硫酸化單糖。與P4和P5相比，寡糖組分P3具有更高的分子質(zhì)量，同時(shí)也具有一定的硫酸基團(tuán)含量，這可能是導(dǎo)致P3抗凝血活性高于P4和P5主要原因。

圖10 寡糖組分P3的結(jié)構(gòu)片段Fig. 10 Proposed sequence of oligosaccharide fraction P3

圖11 寡糖組分P3的核磁共振氫譜Fig. 11 1H NMR spectrum of oligosaccharide fraction P3

3 結(jié) 論

從羊棲菜中提取并分離純化得到褐藻糖膠SFF。通過(guò)高效液相色譜法、高效凝膠滲透色譜法、化學(xué)法測(cè)定了褐藻糖膠的單糖組成、分子質(zhì)量、理化性質(zhì)。采用鹽酸降解法將SFF降解成寡糖，并通過(guò)Bio-gel P4凝膠色譜柱有效分離，最終得到5種寡糖組分P1～P5。5種寡糖組分均可延長(zhǎng)APTT，其中寡糖組分P1、P2、P3對(duì)APTT的延長(zhǎng)作用高于P4、P5，P3的延長(zhǎng)作用尤為明顯。5種寡糖組分對(duì)TT和PT無(wú)延長(zhǎng)作用，說(shuō)明SFF寡糖主要對(duì)內(nèi)源性和共同凝血途徑有抑制作用。選擇高抗凝血活性同時(shí)分子質(zhì)量最小的寡糖組分P3進(jìn)行質(zhì)譜分析，探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，寡糖組分P3純度較高，主要由二硫酸化巖藻三糖寡糖片段組成，結(jié)構(gòu)為--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)--Fuc(2SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)--Fuc(2SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)--Fuc(3SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)--Fuc(3SO)。本實(shí)驗(yàn)篩選出一種具有良好抗凝血活性的高純度寡糖組分，揭示其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，豐富了抗凝血褐藻糖膠寡糖的研究。