趙靜宇，陳 泉，馬琳琳，孫歡歡，祁慶生，，王 倩

(1.山東大學(xué) 國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；2.中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過(guò)程研究所 生物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101)

赤蘚糖醇(1,2,3,4-丁醇)是一種四碳糖醇，由于其能替代糖、抗氧化且安全，被廣泛用作食品和藥物添加劑[1-5]，目前已成為低熱量健康食品原料的新寵，其需求量逐年增加。

赤蘚糖醇可以通過(guò)化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法來(lái)合成。由于低產(chǎn)率和高成本，化學(xué)合成法尚未被工業(yè)化[6]。赤蘚糖醇的生物合成研究主要集中在高產(chǎn)赤蘚糖醇的微生物菌株的選擇和發(fā)酵工藝的優(yōu)化上。目前，一些微生物如Aureobasidiumsp.[7]、Torulasp.[8]、Trichosporonsp.[9]、Candidamagnolia[10-11]和Staphylococci[12]可被用于生物法生產(chǎn)赤蘚糖醇。在酵母或真菌中，如在Torulacorallina[8]、Candidamagnolia[10-11]和Ustilaginomycetes[13]中赤蘚糖醇的合成是通過(guò)磷酸戊糖途徑進(jìn)行的[14]。細(xì)菌中的赤蘚糖醇通常是在厭氧條件下情況下通過(guò)6-磷酸己糖濃度增加進(jìn)行積累的。

菌種誘變可以增加赤蘚糖醇的產(chǎn)量。高蕾蕾等[15]用紫外線和有機(jī)溶劑誘變獲得性能穩(wěn)定的釀酒酵母ERY237，在最佳發(fā)酵條件下的赤蘚糖醇產(chǎn)量為87.8 g/L。Ishizuka等[16]用紫外光照射酵母Aureobasidiumsp.SN-124A，并用N-甲基-N′-硝基-N-硝基-胍鹽(NTG)處理，突變體在培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)起泡沫，赤蘚糖醇的最大產(chǎn)量可以達(dá)到164.8 g/L。從蜂蜜中分離出的Moniliellasp.440經(jīng)過(guò)NTG處理后，突變體N61188-12能夠吸收肌醇并微弱吸收赤蘚糖醇，最終赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)到237.8 g/L[17]。

此外，代謝工程方法[18]也可用于增加赤蘚糖醇的產(chǎn)量。編碼甘油激酶和甘油3-磷酸脫氫酶的基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了Yarrowialipolytica吸收甘油的能力，而且當(dāng)甘油激酶和甘油3-磷酸脫氫酶共表達(dá)時(shí)，赤蘚糖醇的生產(chǎn)率可達(dá)到35%[19]。球頭三型孢菌(Trichosporonoidesoedocephalis)在高產(chǎn)赤蘚糖醇的同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生甘油和核糖醇，對(duì)產(chǎn)品的分離帶來(lái)一定困難，可通過(guò)敲除與高滲透壓甘油途徑相關(guān)的HOG1基因得到TO3，從而減少發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物甘油的產(chǎn)生[20]。

赤蘚糖醇的生產(chǎn)也受到培養(yǎng)條件的影響。通常，微生物耐受的糖濃度和滲透壓越高，赤蘚糖醇的生產(chǎn)和產(chǎn)能越強(qiáng)。耐高滲酵母在500 g/L葡萄糖溶液中旺盛生長(zhǎng)并產(chǎn)生赤蘚糖醇[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)可以發(fā)酵甘油生產(chǎn)赤蘚糖醇，產(chǎn)量達(dá)到93.6 g/L，得率為49%[15]。另外，金屬離子也會(huì)影響赤蘚糖醇的發(fā)酵產(chǎn)量。如發(fā)酵Torulasp.時(shí)添加金屬離子Cu2+可以增加細(xì)胞中赤蘚糖還原酶的活性。Mn2+可以改變細(xì)胞的通透性并降低細(xì)胞中赤蘚糖醇的濃度[21]。Mn2+和Cu2+也可以提高三角酵母的赤蘚糖醇產(chǎn)量[15]。

本研究中，筆者從蜂巢、土壤、花粉和花蜜中篩選了1株高產(chǎn)菌株并鑒定為Moniliellasp.MU1。通過(guò)常壓室溫等離子體(ARTP)生物育種系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行誘變，選擇具有高赤蘚糖醇產(chǎn)率的4個(gè)菌株，通過(guò)不同的碳源、葡萄糖濃度和金屬離子對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，以期為后期的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究中使用的土壤、蜂巢、花蜜和花粉是從青島附近的果園和養(yǎng)蜂場(chǎng)收集的。將這些樣品在30 ℃的富集培養(yǎng)基[22](300 g/L葡萄糖，10 g/L酵母粉)上富集3～6 d，然后將樣品轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有20 g/L瓊脂的固體富集培養(yǎng)基中。從富集培養(yǎng)基中選出的單菌落在發(fā)酵培養(yǎng)基(200 g/L葡萄糖，10 g/L酵母粉，1 g/L尿素)[23]中30 ℃、180 r/min培養(yǎng)4 d。

用于發(fā)酵優(yōu)化的培養(yǎng)基中含有10 g/L的酵母粉、1 g/L尿素、200～300 g/L葡萄糖和不同的金屬離子溶液(CuSO4·5H2O 2 g/L，MnSO4·4H2O 50 mg/L，CaCl21 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2 g/L)。將培養(yǎng)基的pH控制在5.5。所選菌株接種到50 mL發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，然后以5%的接種量接種至搖瓶發(fā)酵中。將發(fā)酵搖瓶置于30 ℃或34 ℃的振動(dòng)器中8 d，每24 h取樣一次以測(cè)量葡萄糖剩余量。

限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶及凝膠提取試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；ITS1和ITS4引物(ITS1：cgcaatggttacgatcaccag，ITS4：aggatgcggggtcagtttgcac)由擎科生物科技有限公司合成。

1.2 發(fā)酵產(chǎn)品分析方法

赤蘚糖醇最初是使用薄層色譜法鑒定的[24]。將挑選的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)4 d，并將發(fā)酵上清液用于薄層色譜分析。薄層色譜展開劑為正丁醇-乙酸-水，體積比為4∶ 1∶ 1。顯影液A為1 g/L高碘酸鈉溶液；顯影液B為80 mL的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇、70 mL的蒸餾水、30 mL的丙酮、1.5 mL的鹽酸中加入0.8 g聯(lián)苯胺溶劑，靜置12 h，以備后用。通過(guò)高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株的發(fā)酵液[25-26]，以計(jì)算出每種發(fā)酵液產(chǎn)物的含量。HPLC條件：Waters 510泵，410折射率檢測(cè)器，U6K手動(dòng)進(jìn)樣器，810色譜工作站。4.6 mm×250 mm的Waters NH2色譜柱，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為乙腈與水(體積比 80∶ 20)，流速為1.5 mL/min。

1.3 ARTP誘變方法

為了獲得生產(chǎn)赤蘚糖醇的突變菌株，利用ARTP生物育種系統(tǒng)(清華大學(xué)和北京四清源生物技術(shù)有限公司)。該系統(tǒng)由氣體供應(yīng)控制子系統(tǒng)、同軸等離子發(fā)生器、不銹鋼制成的樣品板和射頻電源組成。將要突變的菌株在搖瓶中培養(yǎng)至指數(shù)期。將15 μL培養(yǎng)物浸在無(wú)菌不銹鋼板上，射頻功率輸入設(shè)為100 W，等離子炬噴嘴出口與樣品板之間的距離為2 mm，空氣流量為10 mL/min，等離子流溫度為25～35 ℃。為了找到最佳的誘變處理時(shí)間，將等離子處理時(shí)間設(shè)置為0、15、30、60、120和180 s。洗滌細(xì)菌樣品，然后將其涂在準(zhǔn)備好的鋼板上進(jìn)行誘變。誘變后，將鋼板浸入含有1 mL無(wú)菌水的EP管中，并以10-2、10-4和10-6的稀釋倍數(shù)涂布鋼板。

2 結(jié)果與討論

2.1 赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的篩選

富集培養(yǎng)收集到的樣品，將選出的20株菌落在高濃度葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d。將發(fā)酵液通過(guò)薄層色譜法對(duì)赤蘚糖醇進(jìn)行鑒定，發(fā)酵液中有較多的赤蘚糖醇積累。通過(guò)HPLC對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：待檢測(cè)的4種菌株(C18、C34、C91、C97)中，赤蘚糖醇的質(zhì)量濃度均超過(guò)40 g/L；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，C91與C97菌株的葡萄糖剩余量為0，而C18和C34菌株的殘?zhí)橇亢芨?，?dāng)葡萄糖初始質(zhì)量濃度為300 g/L時(shí)，分別剩余106和78 g/L。此外4種菌株中均有副產(chǎn)物甘油的產(chǎn)生，其中C91、C97、C18 以及C34菌株的甘油產(chǎn)量分別為3、3、18和19 g/L，C91與C97菌株的甘油產(chǎn)量明顯低于C18與C34菌株。發(fā)酵液中除了甘油、赤蘚糖醇的積累，并未發(fā)現(xiàn)其他的副產(chǎn)物產(chǎn)生。

圖1 4種篩選菌株的產(chǎn)物濃度和葡萄糖消耗情況Fig.1 Product concentration and glucose consumption of the four screened strains

為了鑒定這些篩選到的菌株，合成了真菌ITS序列的引物ITS1和ITS4。選擇赤蘚糖醇產(chǎn)量較高的菌株C18、C34、C91和C97的基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。最后，僅C91菌株被鑒定出來(lái)，將通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行序列比對(duì)，其基本上與真菌ITS序列的大小匹配，確定其為Moniliellasp.。

2.2 ARTP誘變結(jié)果

將C91菌株在搖瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，清洗細(xì)菌并將其涂布在鋼板上。在誘變期間，將離子束照射時(shí)間分別設(shè)置為1、2和3 min。誘變完成后，將細(xì)菌溶液稀釋并涂板。從平板菌落中挑選細(xì)菌后，獲得了135個(gè)MU1突變體，并根據(jù)誘變時(shí)間進(jìn)行了編號(hào)和劃線。對(duì)上述菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中于30 ℃和200 r/min下培養(yǎng)4 d，將發(fā)酵液稀釋100倍并通過(guò)HPLC分析。從這135個(gè)MU1突變菌株中選出了赤蘚糖醇產(chǎn)量超過(guò)15 g/L的22個(gè)菌株，赤蘚糖醇、葡萄糖的濃度和糖轉(zhuǎn)化率如圖2所示。由圖2可知：這些突變菌株中赤蘚糖醇的產(chǎn)量大小范圍為20～60 g/L，最高產(chǎn)量可以達(dá)到60 g/L的突變株分別是YE-A12、YE-B18和YE-B29?；趯?duì)糖轉(zhuǎn)化率的分析，選擇YE-A3、YE-A27、YE-B10和YE-B22作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)菌株，它們糖轉(zhuǎn)化率大于60%，分別為62.5%、64.3%、64.3%和66.7%。

圖2 ARTP突變菌株的赤蘚糖醇發(fā)酵中赤蘚糖醇的生產(chǎn)情況、糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖的消耗情況Fig.2 Erythritol production,sugar conversion rate and glucose consumption in erythritol fermentation of ARTP mutant strain

2.3 赤蘚糖醇發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 不同碳源對(duì)赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響

筆者首先優(yōu)化了在不同碳源下的赤蘚糖醇產(chǎn)量(初始200 g/L葡萄糖或甘油)。在YPD培養(yǎng)基中挑選了4種菌株，分別為YE-A3、YE-A27、YE-B10和YE-B22，添加200 g/L的葡萄糖或甘油，發(fā)酵24 h后檢測(cè)赤蘚糖醇的合成情況，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：上述4種菌株利用葡萄糖生產(chǎn)赤蘚糖醇的能力明顯優(yōu)于甘油。當(dāng)利用甘油作為碳源時(shí)，4種菌株的赤蘚糖醇平均產(chǎn)量為11 g/L，而當(dāng)利用葡萄糖作為碳源時(shí)，4種菌株的赤蘚糖醇平均產(chǎn)量高達(dá)30 g/L。同時(shí)，當(dāng)利用葡萄糖作為碳源時(shí)，最佳菌株YE-B10可以產(chǎn)生40 g/L的赤蘚糖醇，是利用甘油作為碳源的赤蘚糖醇濃度的2倍(利用甘油作為碳源時(shí)，YE-B10只能產(chǎn)生20 g/L的赤蘚糖醇)。此外還發(fā)現(xiàn)，不論利用哪種碳源，4種菌株赤蘚糖醇的產(chǎn)量從大到小依次為順序?yàn)閅E-B10、YE-A3、YE-B22、YE-A27。當(dāng)利用甘油作為碳源時(shí)，4種菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量從大到小依次為20、10、7.5和5 g/L；當(dāng)利用葡萄糖作為碳源時(shí)，4種菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量從大到小依次為40、35、25和20 g/L。

圖3 不同碳源對(duì)赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on erythritol production

2.3.2 不同金屬離子對(duì)赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響

為了研究赤蘚糖醇產(chǎn)量與添加金屬離子類型之間的關(guān)系[27](金屬離子分別為Ca2+、Mn2+、Fe2+和Cu2+，最終質(zhì)量濃度為1 g/L、50 mg/L、2 g/L和2 g/L)，在發(fā)酵開始時(shí)，將不同的金屬離子溶液加入搖瓶中持續(xù)發(fā)酵8 d，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：添加Ca2+和Mn2+可以顯著增加這4種菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量，添加Ca2+的效果通常高于Mn2+，添加Ca2+時(shí)4種菌株的赤蘚糖醇平均產(chǎn)量約為62 g/L；添加Mn2+時(shí)4種菌株的赤蘚糖醇平均產(chǎn)量約為50 g/L。與添加Ca2+和Mn2+的效果相比，Cu2+和Fe2+促進(jìn)赤蘚糖醇生成的能力相對(duì)不足。當(dāng)添加Ca2+時(shí)，YE-A27菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為73 g/L ；當(dāng)添加Mn2+時(shí)，YE-B10菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為71 g/L ；當(dāng)添加Cu2+時(shí)，YE-B22菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為28 g/L ；當(dāng)添加Fe2+時(shí)，YE-A27菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為32 g/L 。

圖4 不同離子菌株對(duì)赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different ion on erythritol production

2.3.3 不同菌株葡糖糖代謝及產(chǎn)物積累分析

為了分析葡萄糖初始濃度對(duì)赤蘚糖醇積累的影響，選擇YE-A27和YE-B10作為生產(chǎn)菌株，初始葡萄糖質(zhì)量濃度分別為200和300 g/L[8](均在培養(yǎng)基中)，并提供25 mmol/L Ca2+，考察發(fā)酵液中赤蘚糖醇及甘油積累曲線，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：YE-A27和YE-B10在200 g/L與300 g/L葡萄糖作為初始碳源的情況下分別生長(zhǎng)168、168、192和192 h，赤蘚糖醇產(chǎn)量分別為72.9、97.6、66.3和88.5 g/L。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是YE-A27還是YE-B10菌株，300 g/L葡萄糖作為初始碳源的最大產(chǎn)量普遍高于200 g/L葡萄糖作為初始碳源的最大產(chǎn)量，且YE-A27在300 g/L葡萄糖作為初始碳源的情況下獲得最高赤蘚糖醇產(chǎn)量97.6 g/L。此外，在YE-A27和YE-B10菌株中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)現(xiàn)象，除YE-B10在300 g/L葡萄糖作為初始碳源的情況下不明顯外，其余發(fā)酵情況下的甘油濃度先升高后降低，且無(wú)論在何種濃度葡萄糖作為初始碳源，YE-B10菌株生成最大甘油量的時(shí)間普遍長(zhǎng)于YE-A27菌株。因此推測(cè)，在發(fā)酵初期葡萄糖濃度較高時(shí)，該菌株可以利用葡萄糖產(chǎn)生赤蘚糖醇，也可以合成甘油；葡萄糖耗盡后，產(chǎn)生的甘油可再次用作碳源，從而導(dǎo)致甘油濃度隨之降低。

圖5 不同葡萄糖質(zhì)量濃度下YE-A27和YE-B10的赤蘚糖醇和甘油合成曲線Fig.5 Erythritol and glycerol synthesis curves for YE-A27 and YE-B10 at different glucose concentration

綜上所述，碳源濃度影響會(huì)赤蘚糖醇的產(chǎn)生，初始碳源濃度越高越有利于赤蘚糖醇的產(chǎn)生。在300 g/L葡萄糖和25 mmol/L Ca2+培養(yǎng)條件下，菌株YE-A27的赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為97.6 g/L。

2.4 討論

由于市場(chǎng)對(duì)赤蘚糖醇的需求不斷增加，赤蘚糖醇的生物合成和產(chǎn)率的優(yōu)化變得越來(lái)越重要。盡管在含有葡萄糖或果糖的合成培養(yǎng)基上發(fā)酵赤蘚糖醇的研究較多，但是很少有關(guān)于討論使用不同碳源生產(chǎn)這種多元醇的報(bào)道。前期研究時(shí)，筆者分別使用葡萄糖和甘油作為碳源來(lái)研究赤蘚糖醇的生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)甘油作為碳源不適合于工程菌株生產(chǎn)赤蘚糖醇。此外，金屬離子與赤蘚糖醇的產(chǎn)生密切相關(guān)，而Cu2+和Mn2+已被證明對(duì)Torulasp.產(chǎn)生赤蘚糖醇非常有益[21]。據(jù)推測(cè)，Ca2+的添加可能影響工程菌株中與赤蘚糖醇合成有關(guān)的酶的活性，或通過(guò)改變細(xì)胞的滲透性來(lái)促進(jìn)赤蘚糖醇的產(chǎn)生。

赤蘚糖醇生產(chǎn)的優(yōu)化可以通過(guò)控制葡萄糖濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)。通常，如果微生物能耐受的糖濃度和滲透壓越高時(shí)，碳源葡萄糖的初始濃度越高，對(duì)赤蘚糖醇的產(chǎn)率和產(chǎn)量越有益。筆者總結(jié)了不同菌株在以葡萄糖或者甘油為底物時(shí)赤蘚糖醇的產(chǎn)量(表1)，以葡萄糖為底物時(shí)比以甘油為底物時(shí)的產(chǎn)量普遍偏高。2009年，Jeya等[28]使用葡萄糖作為碳源，在分批飼料培養(yǎng)中對(duì)P.tsukubaensisKN75進(jìn)行有氧培養(yǎng)，赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)到241.0 g/L。Moniliellasp.是一種滲透性酵母，對(duì)葡萄糖濃度的合理控制有助于提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量。在本研究中，與在含有200 g/L葡萄糖的高滲培養(yǎng)基中相比，Moniliellasp.在含有300 g/L葡萄糖的高滲培養(yǎng)基中能更好地產(chǎn)生赤蘚糖醇。

表1 不同菌株中赤蘚糖醇的產(chǎn)量及產(chǎn)率分析Table 1 Analysis of yield of erythritol in different strains

3 結(jié)論

筆者篩選了在蜂巢中產(chǎn)生赤蘚糖醇的菌株。通過(guò)突變育種和發(fā)酵條件的優(yōu)化，赤蘚糖醇的產(chǎn)量提高到了97.6 g/L，且金屬離子的類型對(duì)赤蘚糖醇的生產(chǎn)有較大的影響，尤其Ca2+的添加可以提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，碳源也對(duì)赤蘚糖醇的生產(chǎn)有影響。當(dāng)使用葡萄糖作為碳源時(shí)，高濃度的碳源有利于赤蘚糖醇的生產(chǎn)。添加輔助碳源可能會(huì)增加赤蘚糖醇的產(chǎn)量，這將在以后的研究中進(jìn)一步研究。