邱小明

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建 漳州 363000;2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建 漳州 363000)

海藻(Algae)是海洋中的生產(chǎn)者，主要包括綠藻、紅藻、藍(lán)藻和褐藻四大類[1]。隨著人們對海藻的不斷認(rèn)識，人類對海藻的利用也由簡單的食用到開發(fā)新型藥物。現(xiàn)今，隨著現(xiàn)代生化分離純化技術(shù)的發(fā)展和各種藥物篩選方法的發(fā)現(xiàn)，人們對海藻的利用取得了更大的成果，從中找到了許多具有抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、抗心血管疾病的重要生物活性物，主要有：多糖類、多酚類、甾醇類、黃酮類、萜類、大環(huán)內(nèi)酯類、環(huán)狀多硫化合物等[2-3]。天然藥物在腫瘤的臨床治療上有副作用小、抗癌譜廣等優(yōu)點，這些優(yōu)點使得海洋藥物研發(fā)具有廣闊的前景[4]。海藻資源是抗癌活性物質(zhì)研究的重要來源之一，利用藻類來開發(fā)研究新的抗腫瘤物質(zhì)一直是研究的熱點，據(jù)美國NCL報告，3.5%的海藻提取物具有抗腫瘤活性或細(xì)胞毒性[5]。近年來從藻類中發(fā)現(xiàn)許多的酮類、甾體、萜類及含氮化合物等結(jié)構(gòu)新穎的物質(zhì)，它們都具有顯著的抗腫瘤活性[6]。從海藻中提取的二十二碳六烯酸(DHA)可以抑制前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞的生長，研究表明增加DHA的攝取量能預(yù)防癌癥的發(fā)生[7-8]。近年來，已上市的海洋抗腫瘤藥物有阿糖苷、曲貝替定和甲磺酸艾日布林等，許多海藻提取物正在實驗和臨床研究中，此外，還有許多的海藻資源待研究開發(fā)。

本研究以福建省四種主要經(jīng)濟(jì)海藻(滸苔、紫菜、江蘺和海帶)為原料，采用石油醚、乙酸乙酯和75%的乙醇三種不同溶劑進(jìn)行提取，得到12種粗提物組分，利用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性檢測評價各組分抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，探討四種海藻提取物與抑制腫瘤細(xì)胞活性之間的關(guān)系。

1 材料與設(shè)備

1.1 實驗原料

紫菜、江蘺、滸苔、海帶購自福建漳浦，四種海藻粉碎過60目篩。

1.2 實驗儀器

FDU-1200真空冷凍干燥箱，SHB-III循環(huán)水式真空泵，實驗室超純水器，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，HQ2200型超聲波清洗器，YRE-202A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，-80℃ULT低溫冰箱，電子天平BA124S、2202S 型，高速離心機(jī)RX15，2.5-1000 μL移液槍，UV-1800紫外可見分光光度計，96孔板，CO2培養(yǎng)箱，倒置光學(xué)顯微鏡，超凈工作臺，DZF-6020型真空干燥箱，立式壓力蒸汽滅菌器，超低溫離心機(jī)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶，SH-1000酶標(biāo)儀，pH計。

1.3 主要試劑

六水合三氯化鐵，甲醇，乙酸乙酯，乙醇，香草醛，葡萄糖，石油醚，福林試劑，硫酸亞鐵，冰醋酸，丙酮，膽固醇，蘆丁，熊果酸，沒食子酸，硫酸，磷酸，二甲基亞砜，鹽酸，無水三氯化鋁，苯酚，磷酸鹽緩沖液，兩性酶素，MTT，胰蛋白酶。

1.4 試劑配制

(1)磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：分別稱取KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，用超純水溶解攪拌并定容至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，室溫保存。

(2)培養(yǎng)基：取滅菌后的帶刻度的玻璃瓶，倒入RPMI-1640培養(yǎng)基，然后加入10%的胎牛血清，0.1%的兩性酶素，1%的青霉素和鏈霉素，搖勻存放冰箱待用。

(3)MTT溶液：避光稱取MTT粉末25 mg于10 mL離心管中，加入5 mL無菌PBS溶解，即配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃避光保存，一星期內(nèi)用完，使用時用無酚紅無血清的培養(yǎng)基稀釋到0.5 mg/mL。

2 實驗方法

2.1 海藻活性物質(zhì)的提取

分別稱取100 g樣品，每種樣品分別用石油醚、乙酸乙酯、75%乙醇提取四次，提取條件：料液比(W/V)1∶10，水浴50℃，攪拌機(jī)攪拌1 h。合并同一種海藻同一種溶劑的提取液，減壓濃縮除去溶劑至少量體積。再轉(zhuǎn)移至已知重量的小培養(yǎng)皿中，減壓真空-40℃干燥或者冷凍干燥至恒重，稱量，從而得到12種海藻粗提物，做好標(biāo)記，置于-20℃冰箱保存。12種海藻粗提物分別為紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、紫菜75%乙醇提取物、江蘺石油醚提取物、江蘺乙酸乙酯提取物、江蘺75%乙醇提取物、海帶石油醚提取物、海帶乙酸乙酯提取物、海帶75%乙醇提取物、滸苔石油醚提取物、滸苔乙酸乙酯提取物、滸苔75%乙醇提取物。將12種海藻粗提物放入-80℃冰箱冷凍后，取出12種海藻粗提物冷凍干燥24 h后，確保海藻粗提物足夠干燥。將干燥后培養(yǎng)皿的總質(zhì)量扣除干燥前培養(yǎng)皿的質(zhì)量計算得出粗提物的質(zhì)量，并計算出提取率。

其中，η表示提取率，α表示所得到提取物質(zhì)量，β表示原料質(zhì)量。

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

(1)細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮盒中取出所需細(xì)胞凍存管，迅速置于37℃水浴解凍，并不斷搖動使管內(nèi)液體盡快溶解。用酒精棉球擦拭凍存管外壁，在超凈工作臺內(nèi)將凍存液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心 5 min,小心吸棄上清液，向離心管內(nèi)加1 mL的培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液。取新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入4 mL的培養(yǎng)基，然后用移液槍吸取細(xì)胞懸液，加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并標(biāo)注。搖勻，放入37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱中適當(dāng)擰松一點瓶口后，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并及時換液[9-10]。

(2)細(xì)胞保種：當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶底80%～90%面積時即可保種。用PBS洗滌2次，加入含1.5 mL胰蛋白酶消化，觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞分散變圓時，吸棄胰酶，加1.5 mL培養(yǎng)基終止消化。用滴管將細(xì)胞吹打均勻，取2 mL離心管，2 000 r/min離心5 min,小心吸棄上清液，向兩離心管內(nèi)加1 mL的培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液。分裝至凍存管(每管1 mL)，再加入DMSO 0.1 mL，-80℃保存過夜，最后放于液氮罐中長期保存，做好記錄。

(3)換液：吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入5 mL新鮮培養(yǎng)基。

(4)傳代：一般當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶底80%～90%面積時即可傳代，吸棄舊培養(yǎng)基，加2 mL PBS輕蕩洗滌2次。加入1 mL 含0.05% EDTA-2Na的0.25%胰蛋白酶，于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓間隙變大，細(xì)胞之間不再連接成片時即可吸棄胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打至形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞液分裝到2～3個細(xì)胞瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)基至5 mL，搖勻，放培養(yǎng)箱37℃，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 海藻提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性評價

2.3.1 海藻提取物母液的制備

取提取的12種海藻粗提物分別稱取0.01 g,加入0.1 mL DMSO中配成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的藥物母液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，保存在冰箱中備用。

2.3.2 MTT法檢測海藻提取物對MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用

(1)取生長狀態(tài)良好的處對數(shù)生長期的各種細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔100 μL，5 000～10 000個細(xì)胞，培養(yǎng)12 h。

(2)用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基藥物母液分別稀釋成1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL 5個質(zhì)量濃度。

(3)吸棄舊培養(yǎng)基，加入100 μL不同濃度梯度的含藥培養(yǎng)基作為實驗組，同時設(shè)不含藥物的空白對照組、不含藥物與細(xì)胞的調(diào)零孔。每實驗組設(shè)5個復(fù)孔，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。

(4)吸棄藥液，PBS輕洗，吸棄，每孔加入100 μL MTT溶液(溶于無血清無酚紅培養(yǎng)基中，終濃度0.5 mg/mL)，37℃反應(yīng)4 h。

(5)吸棄含MTT的培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，室溫輕微震蕩10 min，置酶標(biāo)儀于570 nm測吸光度OD值。

3 結(jié)果與討論

3.1 海藻提取物得率

用3種不同的溶劑分別對4種海藻粉各100 g進(jìn)行提取，共得到12種海藻提取物，得率詳見表1。

表1 海藻提取物的質(zhì)量和得率

由表1四種海藻得率分析可見，3種溶劑提取物得率依次為海帶、江蘺、滸苔和紫菜。從3種溶劑分析可見，75%乙醇提取物得率是最多的，均在10%以上，其次是石油醚提取物，在1%～2%之間，而乙酸乙酯提取物最少，均低于1%。

3.2 海藻提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性評價

供實驗用的細(xì)胞株為人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，每孔細(xì)胞為4 000到10 000個，利用前文2.3.2的方法，即MTT比色法，測出其吸光值，計算得到其對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長抑制率。按12種海藻粗提物，5個濃度梯度進(jìn)行試驗，結(jié)果如表2。

表2 海藻提取物對腫瘤細(xì)胞MCF-7的生長抑制率

由表2，12種海藻提取物對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7均有一定的抑制作用，其中紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、江蘺石油醚提取物、海帶石油醚提取物、滸苔石油醚提取物、滸苔乙酸乙酯提取物在濃度為1 000 μg/mL時，生長抑制率達(dá)80%以上。而江蘺乙酸乙酯提取物生長抑制率最高時的濃度為500 μg/mL，從四種海藻的不同溶劑的提取物來看，四種海藻的石油醚提取和乙酸乙酯提取物均有較好地抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，而75%乙醇的提取物中，除滸苔75%乙醇提取物外，其余提取物的最高生長抑制率均在40%以下。從12種提取物來看，提取物的濃度升高與生長抑制率升高呈線性，對于抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7效果較好的是紫菜石油醚提取物和滸苔石油醚提取物。

4 結(jié)論

采用石油醚、乙酸乙酯和75%的乙醇分別從四種海藻中提取得到12種粗提物對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖均有一定的抑制作用，紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、江蘺石油醚提取物、海帶石油醚提取物、滸苔石油醚提取物效果較明顯，其最高的生長抑制率均在80%以上，紫菜75%乙醇提取物、江蘺75%乙醇提取物和海帶75%乙醇提取物的效果最差，均在40%以下。從四種海藻提取物分析可知，抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖效果由高至低依次是滸苔、紫菜、海帶和江蘺，這四種海藻粗提物濃度為1 000 μg/mL時，三種溶劑提取物的平均生長抑制率為：86.684%、72.904%、61.078 %和 58.323%。從三種不同的溶劑分析可見，其提取物抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的作用效果依次為石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和75%乙醇提取物。

海洋獨特的環(huán)境使得海洋生物具有一些自身特別的物質(zhì)，從分析可知四種海藻提取物抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖效果依次為滸苔、紫菜、海帶和江蘺。后續(xù)有望從以上四種海藻中找到作用效果好、副作用小的天然海洋抗癌藥物。