石 磊， 王宇彤， 褚 彬， 丁 寧

1. 北京積水潭醫(yī)院 血液科，北京100096；2. 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所淋巴腫瘤科惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京100142

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細胞異常增殖的惡性腫瘤，以老年發(fā)病較為常見。 白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)介導(dǎo)的非受體酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of tranions， JAK/STAT)信號在腫瘤漿細胞的發(fā)育、生長、抗凋亡以及耐藥發(fā)生中具有重要意義[1]。 IL-6/JAK/STAT通路在包括MM 在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)病機制中起到核心作用[2]。 MM 中的IL-6 主要由骨髓基質(zhì)細胞與巨噬細胞分泌產(chǎn)生[3]。 基質(zhì)細胞和骨髓瘤細胞之間通過相互作用，使微環(huán)境中IL-6 含量增加[4-5]。 自分泌或旁分泌的IL-6 可與細胞膜表面的異二聚體IL-6 受體gp80 及gp130 結(jié)合，形成具有生物活性的六聚體三元復(fù)合體，并誘導(dǎo)下游JAK 激酶發(fā)生磷酸化，從而激活下游STATs、絲裂原活化蛋白激酶、 磷脂酰肌醇-3 激酶等信號通路[6-7]。STAT3 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)移等多種靶基因表達，抑制MM 中IL-6 信號，可上調(diào)腫瘤細胞對于對硼替佐米治療的敏感性[8-9]。 CYT387 為一種高效的JAK 抑制劑。 目前，JAK 抑制劑在MM 中的潛在治療作用研究較少。本研究旨在探討JAK 抑制劑CYT387 對MM 細胞增殖、凋亡的影響及其調(diào)控IL-6/JAK/STAT 信號通路的作用機制。 現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系及患者樣本獲取 MM 細胞株XG-7、U266、RPMI-8266、LP-1 均購自美國ATCC 細胞庫及德國DSMZ 細胞庫。 所有細胞培養(yǎng)條件為IMDM培養(yǎng)基或DMEM 培養(yǎng)基＋10%胎牛血清，培養(yǎng)基內(nèi)需添加谷氨酰胺與青霉素—鏈霉素。 所有細胞均通過短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定。 選取北京積水潭醫(yī)院自2012 年3 月至2015 年3 月收治的26 例MM 患者為研究對象。 對所有患者的的骨髓、髓外腫物等組織進行免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)檢測。 同時選取外周血存在漿細胞的患者中IHC 檢 測 磷 酸 化JAK2 (phosphorylated-JAK2， p-JAK2)陰性患者1 例及p-JAK2 陽性患者2 例的外周血標本進行細胞活力測定檢驗。 采用密度梯度離心分離法采集患者外周血單個核細胞，并利用CD38 分離磁珠對腫瘤細胞進行分選。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞活力與凋亡檢測 對4 個MM 細胞株(XG-7、U266、RPMI-8266、LP-1) 與1 例p-JAK2陰性、2 例p-JAK2 陽性MM 患者的原代腫瘤細胞，分別應(yīng)用0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 和20.00 μmol/L 的CYT387 和對照藥物二甲基亞砜(DMSO)進行處理。 孵育72 h 后，采用CellTiter-Glo細胞活力檢測試劑盒進行細胞活力檢測。 每個濃度組檢測3 次，以CYT387/DMSO 平均值計算細胞活力。 CellTiter-Glo 細胞活力檢測試劑盒購自Promega 公司，Annexin-V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自BD 公司。 所有操作流程均按照說明書嚴格執(zhí)行。

1.3 蛋白免疫印跡檢測 對4 個MM 細胞株(XG-7、 U266、 RPMI-8266、 LP-1) 的 Total-JAK2、p-JAK2進行蛋白免疫印跡檢測。 對XG-7 細胞株使用不同濃度CYT387(0、1、2、5、10 μmol/L)處理10 min后，加用1 mg/L 的IL-6 刺激，并用蛋白免疫印跡法檢測加用及不加用IL-6 的p-STAT3 水平。分別以5 μmol/L CYT387 對LP-1 細胞株處理12、24、48 h。 采用蛋白免疫印跡檢測細胞提取物中半胱氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic acid specific protease-3，caspase-3)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、B 細胞淋巴瘤-特大型(B-cell lymphoma-extra large，BCL-xL)、B 細胞淋巴瘤/白血病2(B-cell lymphoma/leukemia 2，BCL2)水平。 蛋白免疫印跡檢測: 將等量的蛋白質(zhì)(10 μg)上樣，恒定電壓80 V，跑膠180 min，直到蛋白至預(yù)制膠的底部。 聚偏二氟乙烯轉(zhuǎn)膜后，加入適當?shù)囊豢?、二抗進行孵育，最后在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)上進行檢測。 使用Image J 軟件對結(jié)果進行定量和分析。

1.4 IHC 檢測 對26 例MM 患者的骨髓組織進行IHC 檢測。 利用磷酸化STAT3 (phosphorylated-STAT3，p-STAT3)和p-JAK2 抗體對福爾馬林固定的石蠟包埋切片進行免疫組化實驗。 石蠟切片經(jīng)高壓抗原修復(fù)、血清封閉、抗體孵育、DAB 顯色等步驟后，由2 位病理科醫(yī)師對每例樣本染色進行評分，包括染色強度與陽性百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。 計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JAK2 在MM 腫瘤組織與MM 細胞系中表達 26 例MM 腫瘤組織中，13 例(50%)呈p-JAK2陽性表達。 蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，在XG-7、U266、RPMI-8226、LP-1 細 胞 株 中Total-JAK2、p-JAK2 表達均呈陽性。 見圖1。

2.2 CYT387 對IL-6/JAK/STAT 信號通路STAT3活化的影響 與對照組(0 μmol/L)比較，隨著CYT387 濃度增加，p-STAT3 的表達顯著降低，且呈濃度依賴性(P ＜0.05)。 外源IL-6 的刺激可整體提高p-STAT3 的表達，但并不能改變CTY387 呈濃度依賴性顯著降低p-STAT3 表達的趨勢(P ＜0.05)。 見圖2。

圖1 JAK2 在MM 腫瘤組織與MM 細胞株中表達(a.MM 腫瘤組織中p-JAK2 陽性表達；b.MM 腫瘤組織中p-JAK2 陰性表達；c.4 種MM 細胞株中Total-JAK2、p-JAK2 表達情況)

圖2 CYT387 對IL-6/JAK/STAT 信號通路STAT3 活化的影響(a. 蛋白免疫印跡法；b. 灰度分析)

2.3 CYT387 對MM 細胞增殖活性影響 隨著CYT387 濃度增加，XG-7、U266、RPMI-8266 和LP-1細胞活力降低，且呈濃度依賴性(P ＜0.05，圖3a)。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，MM 原代腫瘤細胞的JAK2 的磷酸化情況與IHC 檢測結(jié)果一致(圖3b)。隨著CYT387 濃度增加，3 例MM 原代腫瘤細胞活力降低，且呈濃度依賴性，而p-JAK2 陽性的2 例MM 原代腫瘤細胞活力降低更為顯著(P ＜0.05，圖3c)。 見表1、表2、圖3。

2. 4 CYT387調(diào)控凋亡通路相關(guān)蛋白的表達 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，采用5μmol/L 的CYT387 處理LP-1 細胞株12、24、48 h，其凋亡通路相關(guān)蛋白caspase-3 表達處于高水平，而BCL-xl、BCL-2、PARP表達水平逐漸下降，CYT387 對凋亡通路蛋白的調(diào)節(jié)作用具有時間依賴性(P ＜0.05)。 見圖4。

表1 不同濃度CYT387 處理后MM 細胞株細胞活力檢測結(jié)果(ˉx±s)

表2 不同濃度CYT387 處理后3 例MM 患者原代腫瘤細胞活力檢測結(jié)果(ˉx±s)

圖3 不同濃度CYT387 處理細胞株與MM 原代腫瘤細胞的細胞活力檢測(a.MM 細胞株；b. 蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果；c. 原代腫瘤細胞)

3 討論

近年來，雖然以蛋白酶體抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑為代表的新靶向治療藥物及自體造血干細胞移植能明顯提高MM 患者的緩解率，但是MM 仍不可治愈，絕大多數(shù)患者終將復(fù)發(fā)[10]。 復(fù)發(fā)后患者生存期逐步縮短，最終會因為病情復(fù)發(fā)、耐藥和/或進展而死亡，因此迫切需要嘗試新的藥物進行挽救性治療以延長生存期。

IL-6/JAK/STAT 信號通路在MM 的腫瘤發(fā)病機制中起到重要作用。 STAT3 是STATs 家族成員，是一種重要的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，IL-6/JAK 信號通路被激活后，STAT3 可以調(diào)控大量下游靶基因的表達。 IL-6 促進肝再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)的STAT3 依賴性轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而高PRL-3 重新磷酸化STAT3 并異常過度激活STAT3 靶 基 因[2]。 JAKs 家 族 蛋 白 包 括JAK1、JAK2、JAK3 和TYK2[6]。 本研究中，約50% MM 患者原代腫瘤細胞及全部4 株MM 細胞株的JAK2 磷酸化陽性，呈現(xiàn)激活狀態(tài)，且在MM 患者原代腫瘤細胞中證實了蛋白免疫印跡和IHC 方法的一致性， 為JAK 抑制劑靶向治療MM 提供了理論基礎(chǔ)。

圖4 CYT387 調(diào)控凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(a. 蛋白免疫印跡法；b. 灰度分析結(jié)果)

蘆可替尼作為首個應(yīng)用于臨床的JAK 抑制劑，能增強達雷妥尤單抗介導(dǎo)的MM 細胞株和患者CD138 ＋原代MM 細胞的抗體依賴性細胞毒性[11]。同時，蘆可替尼與硼替佐米、來那度胺、地塞米松聯(lián)合，可抑制MM 細胞株的增殖并誘導(dǎo)細胞周期停滯[12]。 蘆可替尼治療同時患有骨髓增殖性腫瘤和冒煙型骨髓瘤的散發(fā)病例時，其骨髓瘤血液指標也有所改善[13]，表明其具有抗MM 作用。 其他JAK抑制劑，如INCB20、INCB16562、AZD1480，均在異種移植小鼠模型中展現(xiàn)了良好的抗腫瘤活性[14-16]，但相關(guān)研究較少。 CYT387 作為一種新型的JAK 抑制劑，其對MM 細胞的作用罕有報道。

本研究結(jié)果顯示，隨著CYT387 濃度增加，所有4 個MM 細胞株及原代MM 細胞的細胞活力呈濃度依賴性降低，尤其是p-JAK2 陽性的原代MM 細胞降低更為明顯，這表明CYT387 對JAK2 被激活的MM 細胞增殖存在明顯抑制作用。 本研究結(jié)果還顯示，隨著CYT387 濃度增加，MM 細胞株中p-STAT3的表達呈濃度依賴性顯著降低。 提示CYT387 可抑制JAK 下游STAT3 的激活。 這表明，CYT387 可通過抑制IL6/JAK/STAT 信號通路的激活導(dǎo)致MM 細胞增殖受抑。 而外源IL-6 的刺激雖然可以整體提高p-STAT3 的表達，但并不能改變CTY387 濃度依賴性抑制STAT3 磷酸化的趨勢。 有研究報道，另一種JAK2 抑制劑AG490 可通過抑制JAK2 激酶活性和STAT3 磷酸化，抑制骨髓瘤細胞株的細胞增殖活性[17]，與本研究結(jié)果類似。

JAK/STAT 調(diào)控的下游信號中細胞凋亡靶點BCL2 家族蛋白的一部分，如BCL2、BCL-xL 等可阻止細胞凋亡。 caspase-3 和其最主要剪切底物PARP，在細胞凋亡中亦起到重要作用。 PARP 在被caspase-3 剪切后失去其酶活力，致使核酸內(nèi)切酶活性增高，裂解小體間DNA，導(dǎo)致細胞凋亡。 本研究發(fā)現(xiàn)，CYT387 呈時間依賴性降低BCL2、BCL-xL、PARP 的表達，并誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 高表達。 這提示，CYT387 可誘導(dǎo)腫瘤細胞內(nèi)凋亡相關(guān)通路激活，導(dǎo)致MM 細胞凋亡。 Alas 等[18]研究顯示，有JAK1 抑制作用的Piceatannol 與JAK2 抑制劑AG490 也被證明可降低BCL2 和BCL-xL 的表達，致使MM 細胞株對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡更加敏感。

綜上所述，CYT387 可通過阻斷MM 細胞內(nèi)IL-6/JAK/STAT 信號通路，抑制腫瘤增殖，同時可引發(fā)凋亡相關(guān)蛋白活化，并抑制組織凋亡的相關(guān)蛋白活性，從而誘導(dǎo)MM 細胞凋亡，有望為MM 的治療開辟新方向。