孫 平，楊兵坤，張彥坤，謝鵬飛，張春暖，徐世曉

(1.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023;2.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所，青海 西寧 810008)

0 引言

塑料因其穩(wěn)定的物理和化學(xué)性質(zhì)在眾多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，其全球產(chǎn)量和使用量逐年增加，因其難以降解導(dǎo)致塑料垃圾在環(huán)境中大量積累[1]。隨著時間的推移，塑料垃圾被分解成不同大小和形狀的塑料碎片，其中粒徑小于5 mm的塑料碎片稱為微塑料[2](microplastics，MPs)。微塑料尺寸小、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，很難通過污水處理系統(tǒng)徹底清除，因此可能在水環(huán)境中廣泛存在[3]。已有研究表明，懸浮于水環(huán)境中的微塑料可被浮游生物[4]、魚類[5]、鳥類[6]和其他海洋類生物[7]等誤食，這些被誤食的微塑料大部分會隨糞便直接排出體外，少部分滯留于消化道內(nèi)[8]，通過多種途徑造成腸道組織病理學(xué)及功能學(xué)改變，影響腸道微生物穩(wěn)態(tài)[9]。然而，關(guān)于不同粒徑微塑料對淡水魚類腸道毒性作用的影響還有待進(jìn)一步探究。

腸道是抵御外源性物質(zhì)的關(guān)鍵防線，也是動物消化、吸收和免疫的重要器官[10]。到目前為止，越來越多的證據(jù)表明在生物體內(nèi)參與微塑料消化的酶的數(shù)量有限，這也意味著機(jī)體所攝入的微塑料會在腸道中長期存在而難以消化[11]。劍尾魚是一種小型熱帶淡水魚類，也是中國首個通過審定的淡水魚類實驗動物[12]。其體型小、易飼養(yǎng)、繁殖力強、繁殖周期短、對多種重金屬毒物較敏感，且劍尾魚在體型和第二性征等形態(tài)特征方面存在明顯性別差異[12]，可廣泛應(yīng)用于水環(huán)境監(jiān)測、水產(chǎn)藥物安全性評價、化學(xué)用品毒性檢測、動物疾病檢驗?zāi)Ｐ图斑z傳生物學(xué)等研究領(lǐng)域[13]。

據(jù)報道，微塑料顆粒的大小是影響其生物毒性的重要因素[14]，如斑馬魚(Daniorerio)在0.5 μm微塑料環(huán)境中較在50 μm微塑料環(huán)境中的毒性效應(yīng)更嚴(yán)重[15]，證實微塑料毒性存在尺寸依賴。而且最近許多研究提出了微塑料顆粒暴露后，腸道微生物菌群改變與腸道毒性之間存在一定的關(guān)聯(lián)。如文獻(xiàn)[16]將鯽魚(Carassius)暴露于聚苯乙烯微塑料環(huán)境30 d后，腸道微生物組成中厚壁菌門豐度增加，擬桿菌門豐度減少，且Alpha多樣性指數(shù)顯著增加。將金頭鯛(Sparusaurata)暴露于聚苯乙烯微塑料30 d后，通過組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其腸上皮出現(xiàn)出血、壞死現(xiàn)象并伴隨有嚴(yán)重的腸上皮空泡化，而腸道微生物豐富度、多樣性沒有顯著差異，僅物種組成差異分析中存在變化，文獻(xiàn)[17]推測微生物組成變化旨在抵消攝入微塑料而造成的機(jī)械損傷。因此，本文推測在劍尾魚腸道中的不同粒徑微塑料也會不同程度引起其腸道損傷，包括組織損傷和腸道微生物菌群變化等。本研究將淡水魚類劍尾魚暴露于1×107microspheres·L-1的微塑料水環(huán)境中72 h[19]，通過組織病理學(xué)和16S核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid，rRNA)測序，探究不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道組織結(jié)構(gòu)及腸道菌群的影響，以期為微塑料對淡水魚類的毒理效應(yīng)影響提供數(shù)據(jù)支持，也為生產(chǎn)中更好地監(jiān)控微塑料污染提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗用魚

本試驗中使用到的微塑料為球形單分散綠色熒光微塑料顆粒(粒徑分別為1 μm和5 μm)，購自于天津倍思樂技術(shù)開發(fā)中心。微塑料基質(zhì)為聚苯乙烯塑料，可以均勻分散于水中。最大激發(fā)波長為470 nm，最大發(fā)射波長為526 nm。微塑料粒徑分布是通過Multisizer 4e庫爾特計數(shù)及粒度分析儀按照庫爾特原理方法進(jìn)行檢測的。

試驗所用到的5月齡雄性劍尾魚(體長為(5.56±0.55) cm，體質(zhì)量為(1.63±0.29) g)購買自陜西紅劍尾魚養(yǎng)殖基地，所有魚均為紅眼紅體。選擇雄性劍尾魚開展試驗的原因是劍尾魚屬胎鳉科、卵胎生魚類，仔魚自母體產(chǎn)出后即可自由生活。一般4月齡左右出現(xiàn)追逐、嬉戲等性行為，5月齡左右可以產(chǎn)出仔魚，為避免雌魚在試驗過程中造成影響，故選用雄魚。依據(jù)GB/T 39649—2020《實驗動物 實驗魚質(zhì)量控制》中試驗動物飼養(yǎng)條件，在試驗室暫養(yǎng)14 d后選擇健康狀況良好、生長指標(biāo)相近的個體開展受控試驗。試驗動物暫養(yǎng)及試驗過程中保持水環(huán)境溫度為(27±1) ℃(pH7.4±0.2)，光周期14 h L∶10 h D。其中，飼養(yǎng)過程中水體經(jīng)過24 h曝氣及活性炭處理(氧溶解度≥5.7 mg/L)。投喂的飼料購買自深圳寸金觀賞魚飼料有限公司，暫養(yǎng)及試驗過程中每天8：00和17：00分別投喂1次，飼料投喂量為劍尾魚體質(zhì)量的3%。

1.2 試驗設(shè)計

試驗分為3組：M0組(對照組)、M1組(1 μm、1×107microspheres·L-1)和M2組(5 μm、1×107microspheres·L-1)(見表1)，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)10尾魚，共90尾魚。文獻(xiàn)[20]研究表明，直徑小于5 μm的微塑料顆粒會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)機(jī)體各個組織器官，故本試驗選用1 μm和5 μm粒徑微塑料顆粒。此外，文獻(xiàn)[21]提出水環(huán)境中的微塑料含量可達(dá)到1×106microspheres·L-1，本試驗選擇1×107microspheres·L-1以期預(yù)測當(dāng)水環(huán)境中微塑料含量升高后會對水生生物造成的影響。暴露于微塑料環(huán)境中72 h后，用MS-222(Sigma，10 mg/L)對試驗魚進(jìn)行麻醉，每個重復(fù)中各隨機(jī)取6尾魚，即每個處理組18尾魚，用75%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇擦拭腸道外壁，用鑷子去除附著于表面的脂肪，用生理鹽水漂洗3次，取3尾魚的腸道作為1個樣本量，即每個處理組中6個樣本，將各個樣本裝入提前編號并已滅菌的EP管中，迅速放進(jìn)液氮罐，用于腸道微生物的檢測。從每組中取出剩余的4尾魚(試驗過程中并未出現(xiàn)死亡個體)，用75%乙醇擦拭腸道外壁，置于解剖盤中擺成Z字型，截取1 cm左右的中腸，用鑷子去除腸道組織表面的脂肪及腸道內(nèi)容物后放入提前編號裝有通用型固定液的EP管中保存，用于制作組織切片。

表1 不同處理組中微塑料暴露粒徑及含量

1.3 指標(biāo)測定與數(shù)據(jù)處理

腸道組織切片采用石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin staining，HE)染色，切片制作完成后應(yīng)用顯微鏡(OLYMPUS CX31)拍照，并通過Biolife Std顯微圖像分析軟件測量腸絨毛長度、隱窩深度、絨隱比(絨毛長度與隱窩深度的比值)、肌層厚度、杯狀細(xì)胞數(shù)量。采用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示差異顯著。

腸道微生物采用16S核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid,rRNA)測序分析，主要包括基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)抽提、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增、文庫構(gòu)建及上機(jī)測序和數(shù)據(jù)分析4部分。其中，數(shù)據(jù)處理是將原始PE reads通過質(zhì)控、拼接、去除嵌合體，最終得到序列用于運算分類單元(operational taxonomic unit，OTU)分析，基于操作分類單位OUT聚類分析結(jié)果得出Alpha多樣性、Bata多樣性、物種組成及差異分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果組織形態(tài)

2.1 不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響

微塑料對劍尾魚腸道組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響分別見圖1和表2。由圖1和表2可知：與對照組相比，試驗組中腸道組織形態(tài)均發(fā)生變化，1 μm粒徑組中絨毛長度、隱窩深度、絨隱比、肌層厚度、杯狀細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(P<0.05)。5 μm粒徑組中絨毛長度和杯狀細(xì)胞數(shù)量降低，隱窩深度、絨隱比和肌層厚度顯著升高(P<0.05)。兩試驗組之間進(jìn)行對比，1 μm粒徑組中絨毛長度、隱窩深度、肌層厚度顯著低于5 μm粒徑組(P<0.05)，絨隱比和杯狀細(xì)胞數(shù)量高于5 μm粒徑組。

(a) 對照組中劍尾魚腸道10×10倍顯微圖像

表2 微塑料對劍尾魚腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.2 不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道微生物的影響

2.2.1 16S rRNA基因測序結(jié)果

Alpha多樣性分析測序3組樣品共產(chǎn)生138 039條優(yōu)化序列，各組分別為44 354條(對照組)、45 302條(1 μm粒徑組)和48 383條(5 μm粒徑組)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后，3組樣品總序列均值為46 013。運用Usearch進(jìn)行聚類劃分可操作分類單元(OTU)，3組共有702個OTUs。對照組OTUs為228個，1 μm粒徑組OTUs為244個，5 μm粒徑組的OTUs為230個，1 μm粒徑組和5 μm粒徑組OTUs均高于對照組。以各樣品中分布的OTUs為計算依據(jù)，用MOTHUR軟件中的venn命令對各樣品中菌群的多樣性進(jìn)行分析并構(gòu)建圖。微塑料對劍尾魚腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響見表3。由表3可知：3組共有445個OTUs，其中199個共同的OTUs，占三者總數(shù)的44.72%；1 μm粒徑組與對照組共有238個OTUs，占兩者OTUs總數(shù)的88.15%；5 μm粒徑組與對照組共有244個OTUs，占兩者OTUs總數(shù)的58.37%；1 μm粒徑組與5 μm粒徑組共有229個OTUs，占兩者OTUs總數(shù)的55.18%。每組覆蓋度均≥99.93%，表明各樣品中的微生物種類已基本覆蓋完全。1 μm粒徑組和5 μm粒徑組香農(nóng)指數(shù)(Shannon)低于對照組，表明不同粒徑微塑料均降低了劍尾魚腸道微生物群落多樣性。

表3 微塑料對劍尾魚腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響

2.2.2 各分組在門水平上的差異

在門水平上進(jìn)行物種注釋分析，將每個OTUs中豐度排列前5的序列作為代表序列進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組樣本中主要微生物菌群為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(見圖2)。與對照組相比，1 μm粒徑組腸道微生物中變形菌門和疣微菌門豐度降低，放線菌門和擬桿菌門豐度增加；5 μm粒徑組腸道微生物中變形菌門和疣微菌門豐度增加，厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門豐度降低。1 μm粒徑組與5 μm粒徑組相比，1 μm粒徑組變形菌門和疣微菌門豐度顯著低于5 μm粒徑組，厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門豐度顯著高于5 μm粒徑組(見表4)。

圖2 門水平上的微生物群落

表4 微塑料對劍尾魚腸道菌群排名前5的菌門比例的影響 %

2.2.3 各分組在屬水平上的差異

在屬水平上進(jìn)行物種注釋分析，將每個OTUs中豐度排列前5的序列作為代表序列進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組樣本中主要微生物菌群為韋榮球菌屬(Veillonella)、Reyranella、戈登氏菌屬(Gordonia)、MNG7_norank和鯨桿菌屬(Gemmobacter)(見圖3)。與對照組相比，1 μm粒徑組腸道微生物中韋榮球菌屬、Reyranella、戈登氏菌屬(Gordonia)和MNG7_norank豐度增加，鯨桿菌屬豐度降低；5 μm粒徑組腸道微生物中Reyranella和戈登氏菌屬豐度增加，韋榮球菌屬、MNG7_norank和鯨桿菌屬豐度降低(見表5)。1 μm粒徑組與5 μm粒徑組相比，1 μm粒徑組韋榮球菌屬和戈登氏菌屬豐度顯著高于5 μm粒徑組，Reyranella、MNG7_norank和鯨桿菌屬豐度顯著低于5 μm粒徑組。

圖3 屬水平上的微生物群落

表5 微塑料對劍尾魚腸道菌群排名前5的菌屬比例的影響 %

3 討論

3.1 微塑料對劍尾魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道是吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，其中腸道絨毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)決定了其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力[22]，腸道絨毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)主要包括絨毛長度、隱窩深度和絨隱比等[23]。本研究中，與對照組相比，暴露組中絨毛長度、絨隱比和杯狀細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(P<0.05)，其中，5 μm粒徑組中隱窩深度顯著高于對照組和1 μm粒徑組。絨毛長度的降低意味著腸道的吸收面積減少，機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少[24]，而隱窩深度的增加則會減弱腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。也就是說，不同粒徑微塑料暴露均可能引起劍尾魚的能量供應(yīng)不足，其中，5 μm粒徑組的影響效應(yīng)更大。相關(guān)研究表明，將斑馬魚(Daniorerio)暴露于5 μm和20 μm的聚苯乙烯微塑料7 d后，與對照組相比，67%的個體腸道組織中出現(xiàn)絨毛縮短腫脹、腸細(xì)胞空泡化等[25]現(xiàn)象。此外，研究發(fā)現(xiàn)黑鯽(Carassiuscarassius)間接攝食24 nm聚苯乙烯微塑料后，50%的個體腸道出現(xiàn)損傷，表現(xiàn)為肌層厚度增加、絨毛頂部杯狀細(xì)胞數(shù)量減少等[26]。其中杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，表明腸黏液分泌減少，機(jī)體免疫力下降，與本研究結(jié)果基本一致。也有相關(guān)學(xué)者指出，將歐洲黑鱸(Dicentrarchuslabrax)暴露于3 mm聚氯乙烯微塑料環(huán)境中90 d后，與對照組相比，試驗組中腸道組織嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為漿膜層和黏膜肌層呈水腫狀，血管擴(kuò)張明顯，白細(xì)胞浸潤等[27]。此外，將金魚(Carassiusauratus)暴露于0.7 mm纖維塑料環(huán)境中6周后，其腸上皮細(xì)胞分裂嚴(yán)重[28]。本研究中未發(fā)現(xiàn)腸道肌層水腫和腸細(xì)胞分裂現(xiàn)象，推測可能是微塑料暴露時間較短[29]，后期可設(shè)置不同的急性、亞慢性、慢性暴露試驗以驗證不同暴露時間對劍尾魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響。

3.2 在門水平上，微塑料對劍尾魚腸道微生物的影響

腸道微生物群是腸道的重要組成部分[30]，主要參與宿主的食物攝取、能量代謝和免疫調(diào)控等[31]，在促進(jìn)腸道發(fā)育、抵抗病原入侵、調(diào)節(jié)機(jī)體能量吸收和維持腸道健康的過程中均發(fā)揮著極其重要的作用[32]。本研究中，與對照組相比，1 μm粒徑組與5 μm粒徑組中香農(nóng)指數(shù)均降低，其中5 μm粒徑組香農(nóng)指數(shù)低于1 μm粒徑組，但差異不顯著。香農(nóng)指數(shù)常用于反映腸道微生物Alpha多樣性，香農(nóng)指數(shù)越小，說明微生物群落多樣性越低。也就是說，1 μm粒徑組與5 μm粒徑組中微生物群落多樣性均降低，且5 μm粒徑組較1 μm粒徑組降低更多。由于腸道微生物的敏感性，腸道微生物穩(wěn)態(tài)已成為新的環(huán)境毒理學(xué)指標(biāo)[33]。如變形菌門豐度增加時可以引起機(jī)體免疫失調(diào)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[34]。擬桿菌門豐度增加時，會降解纖維素、多糖、蛋白質(zhì)等[35]，厚壁菌門則與生物體的能量代謝、糖代謝和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[36]。本研究中，在門的水平上，與對照組相比，1 μm粒徑組的放線菌門和擬桿菌門豐度顯著增加，推測微塑料可能會導(dǎo)致微生物種群失衡，影響細(xì)菌的物質(zhì)代謝。這一結(jié)果與先前關(guān)于斑馬魚的研究結(jié)果基本一致，研究發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚暴露于5 μm和50 μm的聚苯乙烯微塑料環(huán)境7 d后，腸道微生物群發(fā)生顯著變化，其中5 μm和50 μm粒徑組中放線菌門和擬桿菌門豐度增加，影響能量代謝，干擾機(jī)體生長發(fā)育[37]。本研究中，與對照組相比，5 μm粒徑組的變形菌門和疣微菌門豐度顯著增加。這與文獻(xiàn)[38]的研究結(jié)果基本相似，將鹽水蝦(Artemiaparthenogenetica)暴露于30 μm聚苯乙烯微塑料環(huán)境中24 d后，變形菌門豐度明顯增加，機(jī)體生長速度減緩。將斑馬魚(Daniorerio)暴露于8 μm微塑料環(huán)境中21 d后，發(fā)現(xiàn)疣微菌門相對豐度增加，誘發(fā)腸道菌群失調(diào)和免疫反應(yīng)[39]。類似地，文獻(xiàn)[11]將成年雄性斑馬魚暴露于0.5 μm和50 μm聚苯乙烯微塑料環(huán)境中14 d后，發(fā)現(xiàn)50 μm粒徑組與0.5 μm粒徑組相比，厚壁菌門的豐度顯著增加，而變形菌門、擬桿菌門和放線菌門豐度顯著下降，表明聚苯乙烯微塑料暴露可能通過改變腸道菌群進(jìn)而影響機(jī)體健康，微塑料暴露粒徑越大，毒性效應(yīng)越強。本研究中，1 μm粒徑組與5 μm粒徑組相比，5 μm厚壁菌門豐度顯著低于1 μm，厚壁菌門豐度降低意味著營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力減弱，由此推測5 μm粒徑組比1 μm粒徑組毒性效應(yīng)影響更大，但也有相關(guān)學(xué)者指出，將貽貝(Mytiluscoruscus)暴露于10 μm微塑料環(huán)境21 d后，其腸道微生物群落和豐度并無顯著變化，表明微塑料對腸道微生物的影響可能存在物種差異性[40]。

3.3 在屬水平上，微塑料對劍尾魚腸道微生物的影響

在屬水平上，主要微生物菌群有韋榮球菌屬(Veillonella)、Reyranella、戈登氏菌屬(Gordonia)、MNG7_norank和鯨桿菌屬(Gemmobacter)。韋榮球菌屬是革蘭氏陰性厭氧菌，是分布在口腔、咽部和腸道中的正常菌群，常用于發(fā)酵丙酮酸、乳酸、蘋果酸和草酸等有機(jī)物[41]。Reyranella是革蘭氏陰性需氧菌，是可分解營養(yǎng)物質(zhì)的正常菌群[42]。戈登氏菌屬是一類好氧生長、不游動、輕度抗酸的革蘭氏陽性菌，是一種致病菌，可引起多種疾病，尤其是呼吸道相關(guān)疾病[43]。鯨桿菌屬則可以促進(jìn)多態(tài)水化合物的分解，產(chǎn)生維生素B12[44]。本研究中，在屬水平上，與對照組相比，1 μm粒徑組中鯨桿菌屬豐度降低，5 μm粒徑組中韋榮球菌屬豐度顯著降低，表明微塑料暴露后均會改變劍尾魚腸道微生物菌群豐度，導(dǎo)致微生物群落有益菌豐度相對降低。相關(guān)研究表明，將斑馬魚暴露于5 μm和50 μm聚苯乙烯微塑料環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)兩種不同粒徑的微塑料暴露后，斑馬魚幼魚菌群組成在屬水平上均發(fā)生了變化。其中，與對照組和5 μm粒徑組相比，50 μm粒徑組中Erysipelotrichaceae菌屬的相對豐度顯著下降[45]，與本試驗結(jié)果基本一致。本研究中，5 μm粒徑組韋榮球菌屬豐度顯著低于1 μm粒徑組，可能是5 μm粒徑組腸道損傷程度較1 μm粒徑組更嚴(yán)重，導(dǎo)致正常菌群豐度顯著減少。

4 結(jié)束語

腸道健康對動物機(jī)體至關(guān)重要，腸道組織完整性是環(huán)境-有機(jī)體聯(lián)系的關(guān)鍵組成部分，在營養(yǎng)運輸、滲透調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用，而腸道微生物多樣性及組成是環(huán)境-有機(jī)體聯(lián)系的另一個重要組成部分，它有助于維持宿主健康的營養(yǎng)吸收和能量代謝，兩者共同維持生態(tài)體腸道生態(tài)平衡[13]。總之，在本研究中，1 μm粒徑組和5 μm粒徑組的腸道組織均出現(xiàn)損傷，腸道微生物多樣性及組成均發(fā)生變化，其中，5 μm粒徑組的腸道組織損傷程度和腸道微生物群結(jié)構(gòu)與豐度變化程度均高于1 μm粒徑組。推測微塑料毒性存在尺寸依賴，粒徑越大，毒性效應(yīng)越大。但是不同暴露時間、不同粒徑、不同濃度所造成的毒性影響均不同，因此需要開展更多相關(guān)研究以積累微塑料對生物體的功能性和穩(wěn)定性造成的危害。此外，后期研究中有必要深入進(jìn)行劍尾魚的組織、細(xì)胞和基因水平的試驗，以期為生產(chǎn)中更好地監(jiān)控微塑料污染提供一定的數(shù)據(jù)參考。