叢慧慧，張亞楠，牛丹丹，趙繼華，王正祥

(天津科技大學 化工與材料學院，天津，300457)

淀粉酶法制備葡萄糖是淀粉深加工工業(yè)的重要組成，在我國已形成千萬噸級規(guī)模的大型產(chǎn)業(yè)[1-2]。淀粉酶法制備葡萄糖工藝路線一般為：高溫α-淀粉酶介導下，通過噴射液化將淀粉分子從內部酶解為低分子質量的糊精和低聚合度的麥芽寡糖，再在葡糖淀粉酶和普魯蘭酶的協(xié)同作用下對淀粉液化液進行糖化，最大限度地釋放出葡萄糖[3-5]。

現(xiàn)有的研究揭示，所有植物合成和儲存的淀粉分子皆含有分支結構，即淀粉分子在通過α-1,4糖苷鍵連接葡萄糖單體分子形成直鏈分子的同時，通過α-1,6糖苷鍵進行分支擴展[6]。因此，淀粉酶法制備葡萄糖(高葡糖漿)時，需要對淀粉液化后分子中的α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵進行高效水解，才能實現(xiàn)高葡糖漿的高效制備?，F(xiàn)今，來源于黑曲霉或埃默森籃狀菌(Talaromycesemersonii)的葡糖淀粉酶，是目前為止成功實現(xiàn)商業(yè)化應用的葡糖淀粉酶酶制劑[7]。兩者的催化活性相似，皆為淀粉外切酶，主要通過水解直鏈淀粉分子及其低聚麥芽糖分子末端的α-1,4糖苷鍵，形成葡萄糖產(chǎn)物。盡管研究顯示葡糖淀粉酶對淀粉分子中α-1,6糖苷鍵也具有一定水解活性[8]，但其活性不足以滿足對淀粉制備高葡糖漿的工業(yè)要求。因此，專一水解淀粉分支部位α-1,6糖苷鍵的關鍵酶制劑普魯蘭酶，則成為淀粉酶法制糖的關鍵酶制劑[9-12]。此外，在淀粉酶法制葡萄糖的工業(yè)生產(chǎn)過程中，酶促反應條件基本上是依據(jù)葡糖淀粉酶的最適作用屬性而設定，特別是控制酶解過程在較酸性pH值(pH 4.3)條件下進行，以保證在淀粉糊精被充分水解為葡萄糖的同時，降低葡糖淀粉酶的轉苷副反應，從而提升淀粉到葡萄糖的轉化率和收得率。因此，普魯蘭酶在酸性淀粉糖化條件下的高活性就顯得尤為重要[13-14]。

在前期的研究中，我們成功完成了長野芽胞桿菌普魯蘭酶高產(chǎn)菌株的構建與工業(yè)生產(chǎn)應用[15]。但在運用此酶進行淀粉高葡糖漿工業(yè)化制備中發(fā)現(xiàn)，淀粉糖化后糖液中葡萄糖含量即轉化率有待進一步提升，可能原因在于此普魯蘭酶的最適作用pH與現(xiàn)有葡糖淀粉酶不一致，需要對其糖化工業(yè)應用屬性進一步改進或提升。為此，在前期研究的基礎上，本研究重點對普魯蘭酶的酸性突變體在高葡糖漿制備中的應用屬性和應用價值進行研究，以期對普魯蘭酶酶制劑工業(yè)屬性的進一步分子化提供指導意義，并推動我國復合葡糖淀粉酶制劑制造和質量的提升。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

產(chǎn)普魯蘭酶酸性突變體LoPulA的地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)BL-LoPulA為本實驗室前期構建并保藏，用于普魯蘭酶酸性突變體的制備。

1.1.2 酶與試劑

葡糖淀粉酶商品酶制劑(290 000 U/mL)、普魯蘭酶商品酶制劑(6 000 U/mL)，山東隆科特酶制劑有限公司；葡萄糖、麥芽寡糖、異麥芽糖等標準品，江蘇銳陽生物科技有限公司；麥芽糊精(DE值：12)，美國羅蓋特公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基和相關溶液

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0；若配制固體培養(yǎng)基則添加15～20 g/L瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：乳糖20.0，豆粕粉15.0，棉籽粉10.0，CaCl20.3，(NH4)2SO43.0，K2HPO420.0，KH2PO410.0；pH 7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸性普魯蘭酶的制備與純化

按照本實驗室常規(guī)方法，在含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，通過搖瓶發(fā)酵進行[16]。接種量為10%，37 ℃、220 r/min下?lián)u床培養(yǎng)120 h，發(fā)酵結束后，8 000 r/min離心10 min收集上清液即為粗酶液，粗酶液用于進一步研究。

粗酶液經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、PD-10脫鹽柱脫鹽、超濾管(Millipure)超濾，收集的樣液進一步通過AKTAprime系統(tǒng)(Cytiva)進行純化。蛋白濃度的測定采用Bradford法進行[17]，以牛血清蛋白(上海生工)為蛋白質質量標準參照。

1.2.2 酶活力測定

葡糖淀粉酶酶活力按照GB 1886.174—2016的方法測定。酶活力定義為：在40 ℃、pH 4.6條件下，1 g酶粉(或1 mL酶液)1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖，即為一個酶活力單位，以U/g(或U/mL)表示。

普魯蘭酶酶活力按照GB 1886.174—2016的方法測定。酶活力定義為：在60 ℃、pH 4.5條件下，1 g酶粉(或1 mL酶液)1 min分解普魯蘭多糖產(chǎn)生1 μmol葡萄糖，即為一個酶活力單位，以U/g(或U/mL)表示。

1.2.3 溫度和pH對酶活力的影響

按照本實驗室常規(guī)方法進行[16]。適當稀釋的酶液分別在不同溫度或不同pH下，按照上述酶活力測定方法測定其酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.2.4 葡萄糖漿的制備

稱取30 g麥芽糊精溶于0.2 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，攪拌混勻，用緩沖液最終定容到100 mL，配制成300 g/L的麥芽糊精溶液作為底物。反應體系中葡糖淀粉酶的添加量為150 U/g，普魯蘭酶的添加量為1 U/g，即葡糖淀粉酶與普魯蘭酶用酶量質量之比為150∶1。糖化條件：溫度控制在61 ℃，pH控制為4.3。在糖化過程中，以一定的時間間隔取樣，進行葡萄糖含量測定，并按公式(1)計算葡萄糖當量(dextrose equivalent,DX值)：

(1)

1.2.5 糖譜分析

淀粉葡萄糖漿中組分定量分析，采用HPLC法進行[18-19]。色譜條件：色譜柱為Alltech Prevail Carbohydrate Es 5u，流動相為65%(體積分數(shù))的乙腈，流速為1 mL/min，示差檢測器為Shodex RI-201H，柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL。以保留時間定性出峰組成，以外標法通過出峰面積(Y=326.91X-22.522，R2=0.999 5)計算糖漿中葡萄糖的含量。葡萄糖、麥芽寡糖和異麥芽糖標準品，用ddH2O配制成10 mg/mL的標準品。

2 結果與討論

2.1 淀粉糖化用酶的酶學性質分析

2.1.1 pH對淀粉糖化用酶的影響與最適作用pH范圍

在60 ℃下，分別測定不同pH下淀粉糖化用酶的酶活力，獲得了pH對淀粉糖化用酶酶活力的影響，結果匯總于圖1。葡糖淀粉酶的最適作用pH為4.0，并且在pH 4.0～4.5內均能具有90%以上的酶活力；商品普魯蘭酶(PulA)的最適作用pH為4.8～5.0，在pH 4.5、4.3、4.0下的酶活力分別為其最高酶活力的83%、71%和56%?？梢?，與商品葡糖淀粉酶一起在較低的pH下進行淀粉糖化時，PulA的脫支酶活力無法充分呈現(xiàn)；前期研究獲得的PulA酸性突變體LoPulA的最適作用pH為4.5，在pH 4.3和4.0下的酶活力分別為其最高酶活力的96%和85%?？梢?，LoPulA的最適作用pH范圍應該有利于葡糖淀粉酶主導的淀粉糖化。

圖1 pH對淀粉糖化用酶活力的影響Fig.1 Effect of pH on activities of enzymes for starch saccharification

2.1.2 溫度對淀粉糖化用酶的影響與最適作用溫度范圍

分別在50～75 ℃下測定淀粉糖化用酶的酶活力，結果如圖2所示。葡糖淀粉酶的最適作用溫度為60 ℃，在65 ℃時保持其最高酶活力的93%左右。PulA的最適溫度為58 ℃，但在60和65 ℃下僅具有78%和50%的酶活力，可見，在葡糖淀粉酶最適溫度下進行淀粉脫支時，其酶解作用也無法充分發(fā)揮。酸性LoPulA的最適作用溫度也為60 ℃，但在65 ℃下能保持其最高酶活力的94%以上，其最適作用溫度范圍與葡糖淀粉酶相似。可見，LoPulA的最適作用溫度也十分有利于配合葡糖淀粉酶的淀粉糖化。

圖2 溫度對淀粉糖化用酶的影響Fig.2 Effect of temperature on activities of enzymes for starch saccharification

在淀粉酶法制備葡萄糖漿時，葡糖淀粉酶需要與普魯蘭酶復配使用才能獲得較高葡萄糖收得率。葡糖淀粉酶的主要作用是水解α-1,4糖苷鍵生成葡萄糖，普魯蘭酶則水解α-1,6糖苷鍵生成支鏈多糖，并進一步為葡糖淀粉酶提供易水解底物[20]。由于葡糖淀粉酶本身具有較弱的轉苷活性，在盡可能酸性的條件下進行淀粉糖化可減低葡糖淀粉酶的轉苷副作用所形成的異麥芽糖的量，有利于獲得更好水平的葡萄糖當量(DX值)?？梢姡笇W性質與葡糖淀粉酶相似的酸性普魯蘭酶LoPulA，極有可能改善現(xiàn)有商品普魯蘭酶PulA的淀粉到葡萄糖的收得率。

2.2 酸性普魯蘭酶在淀粉制備葡萄糖漿中的作用

以300 g/L麥芽糊精為底物，在61 ℃、pH 4.3下用葡糖淀粉酶和普魯蘭酶酶解72 h，定時取樣進行葡萄糖含量測定，并計算DX值，結果匯總于圖3。當糖化時間為5 h時，反應體系中添加PulA和LoPulA的DX值已經(jīng)達到了70%以上；繼續(xù)糖化到12 h時，淀粉糖化液的DX值分別達到了89.82%和91.37%；糖化24 h后，淀粉糖化液的DX值達到最大值，分別為95.26%和96.66%，采用酸性普魯蘭酶可以將淀粉到葡萄糖的轉化率提高了1.4%。葡萄糖漿中葡萄糖的含量是評價淀粉糖化的核心指標，不僅決定了高葡糖漿的質量和產(chǎn)品收得率，也是葡萄糖后續(xù)純化和精制的主要成本構成。因此，淀粉糖工業(yè)常常將葡萄糖液的DX值是否高于96%，作為界定淀粉糖化和高葡糖漿制備質量以及評價復合葡糖淀粉酶質量的主要依據(jù)?？梢姡\用普魯蘭酶酸性突變體，明顯有利于葡糖淀粉酶的淀粉糖化和葡萄糖的釋放，對后續(xù)以本研究的酸性普魯蘭酶與現(xiàn)有葡糖淀粉酶間組成高效復合葡糖淀粉酶，也具有重要應用價值。

圖3 酸性普魯蘭酶LoPulA對淀粉制葡萄糖的作用Fig.3 Effect of acidic pullulanase LoPulA on starch saccharification

在淀粉糖化過程中，由于葡糖淀粉酶的轉苷副反應，會將已經(jīng)形成的葡萄糖轉為異麥芽糖等[21-22]。從圖3也可以明顯看出，當糖化接近完成后，葡萄糖漿的DX值呈現(xiàn)緩慢下降的變化。為此，進一步對淀粉制備葡萄糖過程中形成的糖譜組成進行分析，結果如圖4和表1所示。在淀粉糖化液DX值達到最大值時(本試驗條件下為淀粉糖化24 h時)，糖液中仍含有微量麥芽糖和極微量的麥芽三糖。隨著糖化時間的進一步延長，糖液中的麥芽糖和麥芽三糖被進一步水解直至全部被水解；但與此同時，異麥芽糖緩慢形成并隨糖化時間的延長并逐漸增加。

G-葡萄糖；M-麥芽糖；M3-麥芽三糖； M4-麥芽四糖；IM-異麥芽糖圖4 淀粉糖化后期形成異麥芽糖Fig.4 Isomaltose formation in the late saccharification

表1 淀粉制備葡萄糖過程中其他糖份組成與含量Table 1 The type and contents of other sugars existed during starch saccharification

早期研究已經(jīng)確定葡糖淀粉酶由于存在較弱的轉葡萄糖苷活性，其在淀粉糖化后期會催化生成異麥芽糖并在糖液中積累，影響高葡糖漿的質量。此外，異麥芽糖不為絕大多數(shù)工業(yè)發(fā)酵菌種所代謝，會在發(fā)酵培養(yǎng)基中積累為不可發(fā)酵的“殘?zhí)恰盵23-24]。可見，運用復合葡糖淀粉酶的淀粉糖化，有效控制糖化終點對高質量高葡糖漿的制備是有意義的。此外，酸性普魯蘭酶的研制成功，可保證葡糖淀粉酶在淀粉糖化時處于其最適作用條件下進行。此外，隨著高質量普魯蘭酶的低成本生產(chǎn)完成，進一步降低復合葡糖淀粉酶中葡糖淀粉酶的添加量可以實現(xiàn)，后續(xù)將對此進行進一步研究。

3 結論

本研究對普魯蘭酶酸性突變體LoPulA在葡糖淀粉酶淀粉糖化制備葡萄糖的作用與應用價值進行了分析。LoPulA具有與現(xiàn)有葡糖淀粉酶商品酶制劑相似的酶學性質，可與葡糖淀粉酶一起高效水解淀粉為葡萄糖，最高葡萄糖收得率可以達到96.66%，有利于我國高效復合葡糖淀粉酶制劑的研發(fā)，并推動其在淀粉糖工業(yè)中的高效應用和淀粉制糖技術進步。